摘 要：目的 制备石英砂修饰-蛇床子素表面分子印迹材料，用扫描电镜和红外光谱表征，并对分子印迹材料进行吸附性能考察。方法 采用N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷（KH-602）修饰的石英砂作为载体，蛇床子素（OST）为模板分子，甲基丙烯酸（MAA）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交胶剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，甲醇为溶剂制备蛇床子素表面分子印迹材料（MIP），采用扫描电镜观察了分子印迹材料表面，用红外光谱对分子印迹材料的化学结构进行表征。结果 动态吸附表明分子印迹材料对蛇床子素随时间增加吸附量逐渐达到饱和，静态吸附研究分子印迹材料对蛇床子素的最大吸附量（16.71 mg/g），选择性吸附结果表明，分子印迹材料对蛇床子素具有特异的结合性能与分子识别特性。结论 分子印迹材料对蛇床子素具有特异的识别选择性、优良的结合亲和性及洗脱性，蛇床子素分子印迹材料对蛇床子素的吸附能力明显强于花椒毒素和欧前胡素。
蛇床子为伞形科蛇床属植物蛇床Cnidium monnieri (L.) Cuss的干燥成熟果实，内用具有温肾壮阳，外用具有燥湿祛风、杀虫止痒等作用；用于治疗阳痿、宫冷、寒痹腰痛，外治滴虫性阴道炎，手、足癣感染等。蛇床子中主要药理活性成分是香豆素类化合物，其中蛇床子素（osthole，Ost）是其主要成分，含量约占总豆香素的60%[1]。Ost也广泛存在于其他伞形科植物当归、白芷、补骨脂、羌活、独活等中[2]。现代药理实验证明，Ost具增强肾阳虚小鼠的免疫功能[3]、抗氧化[4]、抗诱变、抗肿瘤、抗心律失常等作用[5-6]，以及抗血栓、抗凝血[7]、神经保护等作用[8]。
分子印迹聚合物（MIPs）是通过分子印迹技术合成的对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物，其内部分布有印迹空穴，这些印迹空穴与模板分子在大小、空间结构、结合位点等方面相匹配，因而MIPs具有亲和性好、选择性高、稳定性好等优点[9-12]。目前MIPs已被广泛应用于高效液相色谱分离、毛细管电泳色谱、固相萃取、传感器及膜分离等[13-21]诸多领域。制备MIPs方式有共价法、非共价法和半共价法。这些制备方式，模板分子通过共价键或非共价健与单体分子作用生成可分解的复合物，然后交联聚合，聚合后再通过化学途径将键断裂而除去印迹分子。MIPs通常是制备成块状，碾磨、过筛后取一定粒径范围的颗粒。但是MIPs具有难以洗脱、印迹效率低、不易与识别位点结合、粉碎研磨破坏大量印迹空穴使材料的结合性能降低等缺点。为有效克服上述缺点，研究者们提出了不同的表面分子印迹方法，试图将分子印迹空穴置于具有良好可接近性的固体颗粒表面，从而有利于模板分子的脱除和再结合，提高分子印迹的效率。本实验以硅偶联剂修饰石英砂作为载体[22-23]，Ost为模板分子，甲基丙烯酸（MAA）为单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）为交胶剂，偶氮二异丁腈（AIBN）为引发剂，甲醇为溶剂制备Ost表面分子印迹材料（MIP）。红外光谱和电镜扫描表征表面分子印迹材料，动态吸附、静态平衡吸附以及选择性吸附实验考察该印迹材料对Ost的吸附性能，为表面分子印迹技术应用于分离纯化Ost提供参考和依据。
1仪器与材料
1.1仪器
TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；SHA-GW型多功能振荡仪，金坛市科析仪器有限公司；AL204型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；STA449F3型同步热分析仪，德国NETZSCH公司；JEM-2100透射电子显微镜（TEM），日本JEOL公司；FTIR-7600傅里叶变换红外光谱仪，澳大利亚Lambda Scientific公司。
1.2材料
N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷（KH- 602），山东优索化工科技有限公司；石英砂，100目，新沂市高流镇明盛石英砂厂；Ost，质量分数≥98%，上海如吉生物技术有限公司；花椒毒素，质量分数≥98%，成都植本化纯生物技术有限公司；欧前胡素，质量分数≥98%，贵州迪大生物科技有限责任公司；甲基丙烯酸（MAA，分析纯）、偶氮二异丁腈（AIBN，化学纯），天津市光复精细化工研究所；乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA），分析纯，上海海曲化工有限公司；甲醇，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；盐酸，分析纯，重庆川东化工有限公司。
2方法与结果
2.1表面分子印迹材料的制备
2.1.1石英砂的活化 称取100 g石英砂（100目）置于锥形瓶中，加入100 mL 4 mol/L的盐酸溶液，静置24 h，除去石英砂中的少量无机杂质并增加硅胶表面的羟基数目，蒸馏水洗涤至中性，100℃烘干使石英砂活化。
2.1.2石英砂的修饰 称取10 g活化后的石英砂置于100 mL三颈烧瓶中，加入3 mL KH-602和5 mL乙醇，于72 ℃下搅拌20 h，冷却后用乙腈洗涤滤过，70 ℃烘干24 h，即得硅烷化修饰的石英砂。
2.1.3表面分子印迹材料的制备 称取80 mg Ost溶于20 mL甲醇中，加入3 g硅烷化修饰的石英砂、1 mL MAA、2 mL EDMA、0.2 g AIBN，超声脱气10 min，密封后52 ℃恒温搅拌反应48 h，冷却后用10%乙酸的甲醇溶液除去印迹材料中的Ost，于70 ℃烘干12 h即得Ost表面分子印迹材料（Ost-SMIP）。空白印迹材料（SNIP）的制备方法与上述过程相同，只是不加模板分子Ost。
石英砂经盐酸活化后，石英砂表面带有了大量可反应的硅羟基，使N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷枝接到石英砂表面，形成N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷修饰的石英砂。修饰的石英砂作为载体，Ost为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，在偶氮二异丁腈作为引发剂下进行自由基聚合反应制备Ost-SMIP。在SMIP的制备过程中，模板分子Ost上羰基、烷氧基和双键与石英砂表面上的N-氨乙基-3-氨丙基甲基二甲氧基硅烷上的胺基以及功能单体MAA的羧基通过静电、氢键等非共价键作用形成复合物。
2.2石英砂印迹材料的表征
采用扫描电镜、热分析和红外光谱等方法对所制备的石英砂印迹材料进行表征。红外光谱采用粉末KBr压片共研磨法测试，分辨率2 cm−1，扫描范围450～4 000 cm−1。
图1为活化石英砂、硅烷化石英砂、Ost-SMIP和SNIP的红外吸收光谱图。由图1可见，3 440 cm−1是-OH反对称伸缩振动峰，1 620 cm−1附近的峰为H-OH弯曲振动峰，1 181、1 080 cm−1为Si-O-Si反对称伸缩振动峰。787、685 cm−1为Si-O对称伸缩振动峰，3 002、2 822 cm−1为石英砂的有机物的峰。2 350 cm−1为C-N三键的吸收峰[24]。
取硅烷化修饰的石英砂7 mg样品以10 ℃/min的速度从50 ℃升至600 ℃进行热重分析（TGA）扫描。Ost-SMIP印迹材料和SNIP印迹材料的扫描电镜图见图2，Ost-SMIP材料（图2-A）表面粗糙、凹凸不平，有很多微球堆积，这是因为模板离子洗脱后，留下了很多印迹空穴所致，印迹过程使硅胶表面变得粗糙，不仅增大了吸附表面积，而且使结合位点分布数目增加，利于提高其吸附容量，提高对模板离子的识别能力。SNIP材料（图2-B）表面破碎、不规则且比较平坦光滑。
硅烷化修饰的石英砂的TGA结果见图3，DTG曲线在229、293℃处有2个放热峰，这主要是由于硅烷化修饰的石英砂官能团分2次发生了热分解。硅烷化修饰的石英砂在224～312 ℃内，修饰的石英砂约有32.33%的失重率，403～529 ℃内约有20.03%。由上所知KH-602成功枝接上石英砂表面。
2.3吸附性能考察
2.3.1蛇床子素标准曲线绘制精确称取蛇床子素10 mg用甲醇溶解并定容于100mL量瓶中，摇匀，备用。分别移取0、0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.80 mL蛇床子素溶液稀释至10 mL，用紫外分光光度计在322 nm处测定吸光度（A），以A-质量浓度（C）做图得标准曲线，曲线方程为A＝0.083 2 C－0.006 0，r＝0.999 0，表明蛇床子素在1.5～18.0 μg/mL C与A有较好的线性关系。
2.3.2花椒毒素标准曲线绘制 精确称取花椒毒素10 mg用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，摇匀，备用。分别移取0、0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.80 mL花椒毒素溶液稀释至10mL，用紫外分光光度计在297 nm处测定A，以A-C做图得标 准曲线，曲线方程为A＝0.056 1 C－0.000 8，r＝0.999 7，表明花椒毒素在1.5～18.0 μg/mL C与A有较好的线性关系。
2.3.3欧前胡素标准曲线绘制 精确称取欧前胡素10 mg用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，摇匀，备用。分别移取0、0.15、0.30、0.60、0.90、1.20、1.80 mL欧前胡素溶液稀释至10 mL，用紫外分光光度计在250 nm处测定A，以A-C做图得标 准曲线，曲线方程为A＝0.066 9 C－0.000 1，r＝0.999 1，表明欧前胡素在1.5～18.0 μg/mL C与A有较好的线性关系。
2.3.4动态吸附实验 在4 mL 300 μg/mL Ost溶液中加入40 mg印迹材料，分别恒温振荡3、5、10、15、20、30、40、50、60、70、80 min，移取上清液1 mL，用甲醇定容至10 mL，甲醇作空白，在322 nm处测定A，计算溶液中剩余Ost的质量浓度，用差减法计算聚合物对底物Ost的吸附量（Q）。
Q＝(C0－C)V/W
Q为Ost印迹材料或空白材料的吸附量，C为Ost的平衡质量浓度，C0为Ost的原始质量浓度，W为印迹材料质量，V为吸附溶液体积
图4为印迹材料对蛇床子的吸附动态曲线，从图中可以看出，随着时间的增加，印迹材料对蛇床子的吸附逐渐增大，在0～5 min吸附量增加迅速，5 min后吸附量增加缓慢，30 min达到最大值，最大吸附为16.71 mg/g。等温吸附实验以30 min作为印迹材料的吸附时间。
2.3.5静态吸附实验 在4 mL Ost质量浓度为30、60、90、120、150、180、240、270、300 μg/mL溶液中加入10 mg印迹材料，恒温振荡30 min，移取上清液1 mL，用甲醇定容至10 mL，紫外可见分光光度法测定溶液中剩余Ost的质量浓度。
用静态吸附实验测定了Ost-SMIP和SNIP对Ost的吸附量，绘制静态吸附曲线见图5。从图5可以看出，随着溶液中Ost质量浓度的增加，Ost- SMIP对Ost的吸附量随着质量浓度增加也逐渐增加并最终达到饱和，而SNIP对Ost的吸附量增加缓慢，两者吸附量有明显的区别，Ost-SMIP的吸附量是SNIP的吸附量的2倍。这是由于Ost-SMIP和SNIP在空间结构上有明显的差异，Ost-SMIP存在着与模板空间大小相匹配的孔穴，这可以从扫描电镜图中也可以看到，此孔穴对模板分子有良好的识别性能。SNIP则不具有相应的孔穴，印迹材料上的官能团是无序排列的，因此SNIP中也有与目标分子结合作用的原子或基团，但是对目标分子无特异性的识别，所以吸附量较低。
2.3.6选择性吸附实验 在4 mL质量浓度为300 μg/mL的Ost、花椒毒素和欧前胡素的溶液中加入40 mg印迹材料，恒温振荡30 min，移取上清液1 mL，用甲醇定容至10 mL，甲醇作空白，分别于322、297、250 nm处测定A，计算剩余Ost、花椒毒素和欧前胡素的质量浓度。
为了考察印迹材料对Ost的特异性识别，选择了花椒毒素和欧前胡素作为竞争底物。花椒毒素和欧前胡素都是香豆素类化合物，与Ost具有香豆素母体结构。从图6可以看出Ost-SMIP对Ost的吸附量远大于花椒毒素和欧前胡素，是由于Ost-SMIP中存在与Ost空间大小匹配的空穴因而有极高的选择吸附特性，吸附作用远高于花椒毒素和欧前胡素。SNIP对Ost、花椒毒素和欧前胡素吸附量大体相当，是由于SNIP不具有与目标物的相匹配空穴，因此没有选择性地吸收目标物。
2.4含量测定
准确称取1.000 g蛇床子于100 mL锥形瓶中，加入50 mL甲醇密封，超声30 min。称取1 g印迹材料，均匀装填入自制的色谱柱，用甲醇活化，上样上述上层清液10 mL，然后用5 mL甲醇淋洗，最后用10%的乙酸，甲醇为洗脱液进行洗脱[25]，并将洗脱液定容至10 mL，甲醇作空白，在322 nm处测定A，计算Ost含量，测定的Ost含量为1.82%。
3讨论
表面分子印迹材料是通过合成具有分子识别功能材料，在表面分子印迹材料的制备过程中模板分子通过共价键和非共价键作用而确定表面分子印迹材料基质空穴的形状和大小。所制备的表面分子印迹材料在立体空穴和作用点位上与模板分子互补的结构，因此表面分子印迹材料对模板分子具有极高选择性识别。表面分子印迹材料具有选择性高、制备简单、稳定性好、可重复使用等优点。硅烷修饰石英砂制备的表面分子印迹材料与硅胶为基质的表面印迹材料相比较，具有以下优点：石英砂印迹材料容易液固分离，不需离心等繁琐操作；在石英砂和硅胶硅烷修饰过程中，石英砂和硅胶表面不能完全被修饰，总有少量没有硅烷化石英砂和硅胶，而由于石英砂本身没有空穴不具有吸附能力，硅胶具有空穴有一定吸附能力，因此硅胶为基质的表面印迹材料就会有一定的死吸附，多次使用后，吸附量会相应的降低。本实验制备的表面分子印迹材料吸附最大量16.71 mg/g，吸附平衡时间5 min就基本达到平衡时的吸附量，其原因在于实验用石英砂颗粒直径大具有更大的表面积，导致吸附量大、吸附速度快。
参考文献（略）
来 源：田茂军，雷以柱，李 煜，范志芳，王毅红. 石英砂修饰-蛇床子素表面分子印迹材料的制备 [J]. 中草药, , 50(14):3324-3328.
