夏张悦怿, 杨丙成, 章飞芳*, 梁鑫淼
色谱, , Vol. 37 Issue (9): 932-938
DOI:10.3724/SP.J.1123..03005
替米考星磁性表面分子印迹聚合物的制备及应用
本文亮点
报道了一种替米考星磁性表面分子印迹聚合物吸附剂。它以Fe3O4@SiO2为磁性基质，替米考星为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，通过硅烷化反应在Fe3O4@SiO2表面键合上3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷制备得到。该吸附剂对大环内酯类抗生素表现出高选择性和高富集能力（对4种模型大环内酯的富集倍数为212~675倍）。相比传统的非表面分子印迹聚合物，吸附平衡时间可缩短为30 min，可以重复使用至少6次；结合高效液相色谱-紫外检测，将该吸附剂应用于奶粉中4种大环内酯类抗生素的残留检测，所得检出限和定量限分别为0.58~1.36 μg/kg和1.92~4.55 μg/kg，日内（n=5）和日间（n=3）回收率在83.2%~123.0%之间，RSD均小于12.2%。
背景介绍
大环内酯类抗生素(MACs)是一类广谱性抗生素, 在临床以及养殖和畜牧业上均有广泛使用。但MACs的过量使用以及滥用, 使得细菌对其耐药性不断增加, 残留的抗生素会随着动物食品进入人体, 对人类健康造成威胁和隐患。因此很多国家都对食品中的MACs设置了最大残留限量。如中国农业部第235号文件规定奶类中替米考星和泰乐菌素的最大残留限量均为50 μg/L; 欧盟法规规定奶类中螺旋霉素和替米考星的最大残留限量分别为200 μg/L和50 μg/L。目前针对MACs残留已经发展出了许多配套的分析方法如固相萃取、液液萃取、加速溶剂萃取结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)等。固相萃取需要将吸附剂装填入一个萃取小柱, 萃取过程较为繁琐, 且无法适用于大体积样品处理; 液液萃取需要大量有机试剂; 质谱检测则存在使用和后期维护成本高昂, 较大基质效应干扰等问题。建立MACs分析方法, 有效的样品前处理是关键环节。
在众多的样品前处理技术中, 分子印迹聚合物(MIP)由于其高选择性而具有较大的优势。MIP是通过聚合反应在聚合物中形成一个与模板分子结构互补的空腔, 在萃取时只有与空腔结构匹配的分子才能被吸附, 可有效排除其他物质的干扰, 有利于提高萃取的选择性。目前, MIP在分析化学、药物检测和生物传感器等方面都得到了广泛的应用。但是传统MIP存在空腔包埋太深和空间位阻等问题, 导致模板分子和MIP结合困难以及萃取后不易被洗脱。磁性表面分子印迹聚合物(MS-MIP)可以在很大程度上克服上述问题。
Song等以泰乐菌素为模板, 甲基丙烯酸为功能单体制备出相应的MIP吸附剂, 之后使用LC-MS/MS对动物肌肉中的10种MACs进行了检测; Song等通过沉淀聚合法制备了以托拉霉素为模板的MIP吸附剂, 结合LC-MS/MS实现了猪肉中7种MACs的同时测定。而目前有关用于MACs的MS-MIP吸附剂非常有限, 所能检索到的仅有Zhou等以红霉素为模板, 制备出MS-MIP, 结合HPLC-UV应用于食品中多种MACs的检测。需要指出的是红霉素属于十四元MACs, 而使用最多的MACs类兽药是以泰乐菌素和替米考星为代表的十六元抗生素。目前以十六元MACs为模板的MS-MIP吸附剂尚无文献报道。
本论文以磁性纳米颗粒为基质, 制备了以替米考星为模板的MS-MIP吸附剂, 优化了合成与萃取步骤, 考察了吸附剂的性能并将其应用于奶粉中MACs残留的检测。
实验方法
01
替米考星-磁性表面分子印迹聚合物的制备
称取1.0 g纳米Fe3O4于三口烧瓶中, 加入100 mL去离子水超声使其分散均匀。缓慢滴加25 mL 1.0 mol/L的九水硅酸钠溶液, 边滴加边搅拌, 滴加完成后用4 mol/L盐酸调节溶液pH至6.0左右, 然后80 ℃反应3 h。反应结束后, 依次用甲醇和纯水清洗产物3遍, 最后冷冻干燥得到Fe3O4@SiO2。
取0.5 g干燥后的Fe3O4@SiO2于圆底烧瓶中, 加入0.6 mL MPS, 40 mL无水甲苯和0.5 mL吡啶, 在N2保护下115 ℃、800 r/min反应24 h。反应结束后依次用甲苯、甲醇洗至无色, 干燥后得到Fe3O4@SiO2-MPS。
称取208.6 mg替米考星和250 μL甲基丙烯酸于圆底烧瓶中, 加入40 mL二甲亚砜, 于30 ℃、500 r/min条件下预聚合1 h。然后依次加入300 mg Fe3O4@SiO2-MPS, 55 mg偶氮二异丁腈和120 mg聚乙烯吡咯烷酮。N2保护下60 ℃、800 r/min反应24 h。得到的产物用纯水和甲醇清洗3遍, 60 ℃下干燥12 h后得到MS-MIP吸附剂(其合成路线图见图 1)。
非分子印迹聚合物(MS-NIP)制备方法同上述MS-MIP, 区别是不使用模板分子。
使用30 mL甲醇-乙酸(80:20, v/v)溶液, 超声30 min去除模板分子, 经测定重复洗脱4次可以完全去除模板分子。
02
奶粉样品的前处理
奶粉样品均购自本地超市。称取3 g奶粉加入15 mL乙腈, 超声15 min后以10 000 r/min离心15 min, 收集上清液旋蒸至干, 纯水重溶至15 mL后备用。
结果与讨论01
基质添加标准曲线、检出限和定量限
在经预先检测不含MACs或含量在检出限以下的奶粉样品中添加4种MACs标准品80~800 μg/kg, 按优化后的萃取参数进行萃取, 每个浓度平行实验3次, 绘制基质添加标准曲线(y为4种MACs的峰面积, x为对应的含量), 结果如表 2所示, 在该范围内线性关系良好, R2＞0.99。按3倍和10倍信噪比计算检出限和定量限分别为0.58~1.36 μg/kg和1.92~4.55 μg/kg。
02
加标回收率和精密度
在空白奶粉中分别添加80、200、500 μg/kg的4种MACs混合标准品, 进行方法回收率和精密度考察, 日内每个浓度平行实验5次, 日间为连续3天。4种MACs的日内和日间回收率和精密度均良好, 日内回收率为83.2%~123.0%, 精密度为1.6%~10.2%;日间回收率为83.9%~121.0%, 精密度为1.4%~12.2%。由图 7可看出, 200 μg/kg加标水平的奶粉经过MS-MIP富集后检测得到的色谱图中, 4种抗生素的色谱峰都非常明显, 但相比2.4节中的富集效果图, 这里交沙霉素的峰最高, 替米考星次之, 可能是因为基质不同的原因, 前期实验是在水溶液中进行, 而奶粉基质更加复杂, 干扰物更多, 对奶粉的前处理可能会造成部分抗生素的损失; 600 μg/kg加标水平的奶粉经简单处理后直接用液相色谱检测得到的色谱图中, 4种抗生素中只有交沙霉素和泰乐菌素略有响应, 螺旋霉素和替米考星未检测到; 空白奶粉经MS-MIP萃取后的液相色谱图中, 4种MACs均未检出, 证明本吸附剂可以用于对奶粉中痕量MACs的有效前处理。
●结论●
本文报道了一种以替米考星为模板分子的磁性表面分子印迹聚合物吸附剂。该吸附剂对4种十六元的MACs具有良好的选择性和富集能力, 且吸附平衡时间较短, 可以结合HPLC-UV应用于奶粉中MACs残留的检测, 有望应用于其他类型样品中抗生素痕量残留的前处理。
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