解析发表在European Heart Journal上的Molecular mechanism of endothelial and vascular aging: implications for cardiovascular disease一文
复旦大学附属中山医院，上海市心血管病研究所
邹云增 王时俊 白英楠
科技创新是人类文明发展前进的源动力，其中在医学领域的基础研究则是探索人体遗传密码和进化过程中疾病演化的规律的重要手段。从奥巴马提出“精准医学”口号到全世界风起云涌的各项重大基因组计划的开展，人类医学的基础研究正书写着划时代的篇章。作为目前人类疾病的头号杀手——心脑血管疾病，我们在这一领域的基础研究也发生快速发展和革新，不再是“头痛医头，脚痛医脚”的片面医学理论概念所能解决之道。随着复旦大学附属中山医院的葛均波院士领衔，由中美专家共同讨论协定的“复旦大学泛血管研究院”的揭牌成立，缺血性心脏疾病的研究由单一着眼于心脏局部入手转向整个循环系统的整体研究，仔细想想，不管是冠心病、高血压、糖尿病性心肌病还是心力衰竭等常见心血管疾病，多少与血管病变有着千丝万缕的紧密联系。
我国正在步入老龄化阶段，身体的老化必定带来各个组织器官的功能衰退，作为人体血管的重要组成部分——内皮细胞的老化也是从血管到靶器官致病的重要因素。血管中存在并释放有大量细胞因子，生理病理性激素、炎症因子、氧化应激产物以及其他大量诱导性化学物质，人体衰老是一个非常漫长的过程，长年累月这些物质通过血管系统可作用于远端靶器官，从而对于一种疾病的追根溯源性的机制研究变得非常复杂和困难，特别是如何精准定位治疗或干预的靶点——即当下非常流行的靶向性治疗是对于未来基础研究的重大挑战。作为泛血管疾病基础研究的前沿阵地——血管内皮的结构和功能变化无疑是首要考虑因素。最近于发表于欧洲顶尖心血管领域权威杂志European Heart Journal的一片综述性论文：Molecular mechanism of endothelial and vascular aging: implications for cardiovascular disease（European Heart Journal ：36, 3392–3403），明确提出了血管内皮细胞的老化对于心血管疾病发生发展的重要影响，旨在对衰老及衰老相关的心血管及心脑血管疾病的发病机制和分子信号通路方面进行总结。为在这一领域从事基础研究的科学家们，提供了疾病研究的重要线索和思路，同时也是对未来心血管疾病的基础研究给予重大期望并提出挑战。我们应《门诊》杂志社邀请，在此和读者共同学习和探讨，将针对这篇基础性内容较强的综述做一略微的点评，以使心血管从事基础和临床研究的同仁更好了解血管内皮细胞的病理机制研究对于心血管疾病的重大意义，通过我们共同的思考和探讨，去点亮那些尚处于黑暗未知领域的而极可能是诱导心脑血管疾病的重要作用分子靶点。
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解 读
该论文首先提到了全球包括欧洲正面临人口快速老龄化的严峻挑战，预计到2050年欧洲85岁以上的老人数量将从1400万激增至1900万，而心血管和脑血管疾病的发病率和致死率与年龄的上升有紧密联系。据不完全数据统计，65岁以下死于心脑血管疾病的患者不到30％，而年龄段在65～74的患者个体，该死亡比例超过50％。这一预警性信息提示我们急需找到预防和治疗抗衰老相关分子靶点，从而有效减少随着全球老龄化带来的心脑血管疾病困扰。
目前的关于衰老的分子机制研究，普遍认同细胞或器官的老化与身体不断产生的氧自由基有很大关系，活性氧（ROS）在人体内是以多种形式存在的，有些ROS分子还是身体脏器在进行新陈代谢过程中必不可少的能量来源。然而，随着机体的不断老化，机体产生了大量剩余的ROS分子，以及由ROS衍生的过氧化物，这些对于器官和组织产生了氧化损伤。在这篇综述中就提到了很多与氧化应激损伤有关的分子靶点或蛋白，以及对于这些新型靶点可能的干预措施，在未来的心脑血管疾病研究和治疗中的深远意义。这里重点提到了人体重要的激素调节系统——肾素－血管紧张素－醛固酮系统（RAAS），有别于传统理论上的理解，对于该系统的调节干预不仅仅是降低血压，改善血管舒张功能，同时还间接调节了尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（NADPH）的活性，从而平衡机体ROS的水平，减少氧自由基的产生，恢复一氧化氮合酶的生物活性。更为重要的是，拮抗血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的生物活性，可以有效延缓端粒的缩短。
端粒是位于细胞染色体末端区域的一段高度保守重复序列（TTAGGG），其碱基的长度主要通过端粒酶来维持，目前对于其背后的分子机制还不十分明确。有报道表明，在超过90％的癌症细胞中端粒酶的活性明显增高，同时细胞每分裂一次，端粒就会相应缩短33-120个bp。因此，有学者推测端粒酶的活性降低以及端粒的缩短是细胞衰老的重要标志。而在心脑血管疾病的基础研究中，确实发现端粒的缩短与发病率呈正向关系，其中RAAS系统激活以及氧自由基的大量产生对于端粒的缩短有重要作用。
除了端粒以外，还有一些长寿基因，或者更精确应该叫做衰老相关基因的活化——例如Sirt家族蛋白、sirtuins等也与氧化应激的水平调节密切相关。该文章中重点提到了，Sirt3的单核苷酸多态性（SNP）多个位点与心脑血管疾病的发病种群概率有统计学差异；同时Sirt1的血清学水平过低可能提示代谢综合征；在小鼠实验中，Sirt1或Sirt3的过表达可以增加胰岛素的敏感性，改善糖代谢，并且激活心肌缺血保护基因Akt信号通路，减少内皮细胞老化，促进血管新生，改善心脏局部的缺血状态。此外，最新的抗动脉粥样硬化治疗非常流行和有效的PCSK9抑制剂，通过深入的分子机制研究发现，其背后是Sirt1的活化才导致乙酰化PCSK9的减少，从而降低低密度脂蛋白和胆固醇的含量，对血管粥样硬化的病理性改变起到决定性逆转作用。因此Sirt1对于缺血性引起的心脑血管疾病是一个重要保护因子。
第三个受氧化应激调控的重要衰老相关基因是位于线粒体的接头蛋白p66shc，线粒体是细胞能量代谢的重要器官，同时也是大量ROS衍生物产生的重要场所。研究发现，p66shc通过控制线粒体ATP的生成、以及电子呼吸链促进了线粒体ROS的产生，同时通过开放线粒体膜通透性转运孔（mPTP），造成线粒体膜的不稳定性，以及线粒体的融合或崩解。可以说随着衰老过程中，p66shc蛋白的不断生成，严重影响线粒体的质量和功能，并且加剧了细胞的氧化损伤。实验数据显示，p66shc敲除型小鼠较野生型小鼠的平均寿命，可以长寿30％左右，而通过解剖小鼠尸体发现，基因敲除型小鼠体内的ROS，过氧化物以及NADPH水平都较野生型明显降低，进一步的分子检查发现p66shc是通过激活细胞核内的转录因子c-Jun来实现一系列的生物化学效应。此外，p66shc第36位丝氨酸的磷酸化可以直接活化LDL受体，因此，p66shc的活化与动脉粥样硬化的发生发展也有密切关系。
在此文中，作者还提到了两类重要的干预靶点——转录因子（例如c-Jun）和生长因子（例如GDF11），这些分子同样受到细胞氧化应激水平的调控，同时提示对于它们的干预可能起到心脑血管引起的缺血性损伤的保护作用，并且有效改善衰老带来的心脏功能紊乱。为了便于清晰理解这些衰老相关基因的相互作用及其核心信号通路，我们借用Thomas F. Luscher教授的图例加以阐明。以期为研究衰老相关的心血管/心脑血管疾病的发病机制，尤其是揭示分子信号通路及致病的靶蛋白方面提供重要线索，从而为治疗甚至预防衰老相关的疾病作出贡献。
▲ 图. 受细胞氧化应激水平的调控的心脑血管衰老相关干预靶点
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对我国心脑血管疾病诊治的指导意义
说了那么多新型干预的保护因子，对于目前我国心脑血管疾病的诊治情况的又有些什么指导意义呢？结合复旦大学附属中山医院心血管病研究所的临床经验和基础研究，目前心衰的治疗主要依赖于药物控制症状。对终末期心衰可以考虑心脏移植治疗，但是一方面心脏供体极度有限，治疗费用高昂，手术难度极大，术后还需要应用高额的免疫抑制治疗。其他的心脏植入性机械辅助装置虽然有一定的疗效，但除价格昂贵外，术后需要密切监测装置的性能，辅助抗凝治疗及密切监测凝血功能预防脑出血等并发症。因此其应用均有所受限。从理论上来讲，只要能够增加心室具有收缩功能的心肌细胞数量就可以使衰竭的心脏功能恢复正常。于是在21世纪初，一部分学者开始研究将心肌细胞移植入受损心脏，开启了细胞治疗的新纪元。我们研究所也发表了以细胞为基础的治疗心梗后心功能不全的研究结果。总体来说，目前的治疗效果和临床应用价值仍存在争议。而对于以细胞为基础的治疗衰老相关的心血管疾病更鲜有报道。以细胞为基础治疗心衰的临床目标是通过协同再生出具有收缩功能的心肌细胞和相应的循环系统，其中包括冠状血管，小动脉，以及毛细血管网等。理论上，这一目标可以通过植入多能干细胞来实现。但是，如何完善和重建心脏的毛细血管网从而为再生的心脏细胞提供氧供这一难题仍需攻克。因此我们实验室利用机械牵张这一模型在体外模拟心衰，利用内皮祖细胞的成血管特性来探索改善心衰后心脏氧供的分子机制，从而为改善心衰后的心脏功能提供新的治疗。我们初期的研究成果发现，机械牵张后内皮祖细胞的增殖、迁移、存活力、和成血管的功能都降低，而这四个因素是决定体内环境中维持血管再生和功能完整的关键因素。为改善内皮祖细胞的促血管新生的功能，我们发现通过上调其膜受体VEGFR的内吞，即可通过激活其下游的一系列通路来发挥促进血管新生的作用。这一研究成果即将在5月份见刊，而我们也将进一步完善体内实验，从而为衰老相关的心血管病提供更多的研究思路和治疗靶点。
对于大多数高龄的心脑血管疾病患者，除了个别身体条件允许给予手术治疗包括干细胞移植治疗之外，其他还是以保守治疗即药物治疗为主。而对于这些年龄老化伴随的慢性疾病，早期预防和干预其实是更为有效的措施，各级医院对于心脑血管风险事件的早期干预的教育宣传渐渐在社区人群普及，并且提升到越来越为重要的地位。本文的专家预见到该问题的重要性，在文章中给出了适当的建议：首先，作为患者主体，自身的生活方式的改变最为重要，一种良好的生活习惯被称为是减少心脑血管风险事件的主因。研究发现，适当的体育锻炼，可以增强细胞线粒体功能；通过活化缺氧诱导因子（HIF-1a），增加生长因子VEGF的表达，促进内皮细胞增殖，血管新生，改善心脏功能；同时降低血清低密度脂蛋白水平，改善动脉粥硬化。值得重视的是，运动还可以增加Sirt1的生物活性，通过运动实验使ApoeE基因敲除小鼠的Sirt1水平明显升高，改善肥胖症状，增加胰岛素敏感性，降低血糖和血脂，同时增强线粒体功能。另外，减少卡路里的摄取也是保证Sirt1等长寿基因发挥关键生物学活性的重要因素。给予卡路里限制（Caloric Restriction, CR）饮食的猴子，较对照组平均寿命明显增加，同时发生心脑血管事件的风险率明显降低，其背后的机制推测可能是CR饮食促进了血管eNOS和Sirt1的表达，从而激活了下游大量的血管保护因子的释放。此外，CR饮食还明显减少了机体ROS产物的形成，避免了血管硬化，改善心肌重构和心功能，心肌梗死风险的消费，大大降低了心肌梗死的风险。
其次，医生对于高龄心脑血管疾病患者的适当药物干预的必要性。长期的基础研究结果表明，血管紧张素转化酶（ACE）是干预心脑血管的非常重要靶点之一。血管紧张素转换酶的生物活性直接决定了血管紧张素Ⅰ和血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）的比例，而后者一种强效的血管收缩剂，ACE的活性水平长期过高，导致高血压、血脑管硬化以及并发心力衰竭与动脉粥样硬化的危险。多项临床试验包括，ISIS-4、SAVE和EUROPA等大型研究均提示应用ACE抑制剂可以减少心肌梗死患者的总死亡率，预期寿命延长；此外，其他的一些大型试验，特别是与卡托普利、雷米普利、依那普利等有关的试验，也显示应用ACE抑制剂可降低新发糖尿病患者发生心脑血管事件的发病率；在我们进行的国家十二五支撑计划研究中的心血管病患者在服用ACE抑制剂的长期观察研究中也得到类似结论。除了基础用药干预之外，还有一些生物类辅助制剂在降低氧化应激水平，改善动脉粥样硬化中也发挥非常重要作用。例如，α-生育酚和β-胡萝卜素，在既往心肌梗死男性患者服用α-生育酚的随访观察中发现，与安慰剂相比可大大减少致死率和再次诱发冠心病的风险率；而两者合用的效果更佳显著。另外，研究表明日常补充维生素E，可降低血浆循环氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的水平和氧化易感性，对于延缓动脉粥样硬化的进展等临床事件非常重要。
截止目前，国内外众多知名的心脑血管研究机构对于老龄化引起的心血管和脑血管危险事件的机制研究还处于起步阶段，在血管老化过程中的分子和分子，细胞与细胞间复杂的相互作用，对于血管和心肌的重塑产生重大影响，哪些关键因子参与其中，如何找到正确的干预靶点，这些都还没有完全阐明清楚。在未来的研究中，包括国家十三五重大研究专项支持的重点应该放在寻找精准的细胞内干预靶点，和血液中可靠的生物标志物，在这篇综述中给了我们很好的启示，对于延缓血管老化，改善动脉粥样硬化和减少心力衰竭的发生具有深远意义。
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