麻痹性贝类毒素(PSTs)是生物毒素中危害最大，分布范围最广，事故发生频率最高的一种海洋生物毒素，是由甲藻产生的一类四氢嘌呤类化合物的总称，目前已经分离出20余种。迄今为止，包括中国在已内有20多个国家制定了PSTs相关的限量标准，大多数限量值为80 μgSTXeq/(100 g)。
目前国内外报道的PSTs测定方法主要有小鼠生物法、高效液相色谱法、液相色谱–质谱联用法等，其中液相色谱串联质谱法较其它方法优势明显，因而成为检测方法建立的主要研究方向。GB/T5009.213– 中的小鼠生物法存在灵敏度低、重现性差，无法确定PSTs的种类及各组分的含量等缺点。冯静等对该法的色谱条件进行了优化，选用对极性物质有一定吸附能力的石墨化炭黑固相萃取小柱，小剂量上样以达到对PSTs的吸附，进而对其进行净化，减小基质效应，提高灵敏度的同时获得了理想的回收率和精密度，提高了我国水产品进入国际市场时，用液相色谱–串联质谱法检测麻痹性贝类毒素的灵敏度和准确性。
摘要
建立超高效液相色谱–串联质谱法测定贝类中麻痹性贝类毒素的方法。样品经0.5%甲酸加热提取，石墨化炭黑固相萃取柱净化后，用超高效液相色谱–串联质谱法测定。采用TSK–Gel Amide–80色谱柱(150 mm×2.0 mm，5μm)，以水溶液(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)A，95%乙腈水溶液(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)B为流动相，梯度洗脱，流量为0.3 mL/min，进样体积为10 μL，多反应监测(MRM)模式检测。藤沟藻毒素3、4(GTX3、GTX4)、脱氧藤沟藻毒素3(dcGTX3)的检出限为8 μg/kg，藤沟藻毒素5(GTX5)、新石房蛤毒素(neoSTX)、石房蛤毒素(STX)、脱氧甲酰基类毒素(dcSTX)的检出限为20 μg/kg，藤沟藻毒素1，2(GTX1，GTX2)的检出限为24 μg/kg，脱氧藤沟藻毒素2(dcGTX2)的检出限为28 μg/kg。GTX3，dcGTX3，GTX4的线性范围为4～80 μg/L，GTX5，neoSTX，STX， deSTX的线性范围为10～200 μg/L，GTX1的线性范围为12～240 μg/L，GTX2的线性范围为11～220 μg/L，dcGTX2的线性范围为14～280 μg/L，线性相关系数均大于0.99，平均回收率为82.5%～115.1%，测定结果的相对标准偏差为0.6%～7.5%(n=6)。该方法检出限低，精确度高，适用于水产品中麻痹性贝类毒素的检测。
1 实验部分
1.1主要仪器与试剂
超高效液相色谱–串联质谱仪：Acquity Xevo TQ型，美国Waters公司；
高速冷冻离心机：Thermo ST16R型，美国赛默飞世尔科技公司；
氮吹仪：TurboVap LV型，美国Caliper lifeSciences公司；
固相萃取仪：Vac Elut SPS 24型，美国安捷伦科技有限公司；
漩涡混合器：Vortex–genie2型，美国Scientific industries公司；
ENVI–Carb固相萃取柱：美国supelco公司；
脱氧藤沟藻毒素2,3(dcGTX2,3)、藤沟藻毒素2,3(GTX2,3)、藤沟藻毒素1,4(GTX1,4)、藤沟藻毒素5(GTX5)、新石房蛤毒素(neoSTX)、石房蛤毒素(STX)、脱氧甲酰基类毒素(dcSTX)标准物质：Canada公司；
乙腈、甲酸：色谱纯，美国Fisher公司；
甲酸铵、氨水：优级纯，北京化工厂；
实验用水为超纯水。
1.2实验方法
1.2.1溶液配制
混合标准储备溶液：分别准确吸取10种麻痹性贝类毒素标准物质,以甲醇溶解配制成混合标准储备液，于4℃保存，质量浓度见表1。
1.3仪器工作条件
1.3.1色谱条件
色谱柱：TSK–Gel Amide–80柱(2.0 mm×150 mm，5 μm)；柱温：40℃；样品室温度：4℃；流动相：A相为水溶液(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)，B相为95%乙腈水溶液(含2 mmol/L甲酸铵，50 mmol/L甲酸)，梯度洗脱条件见表3；流量：0.4 mL/min；进样体积：10 μL。
1.3.2串联质谱条件
电喷雾离子源，正负离子切换扫描模式；毛细管电压：3.0 kV；离子源温度：150℃；锥孔反吹气：氮气，流量为50 L/h；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气：氮气，流量为650 L/h；多反应监测(MRM)模式采集。10种麻痹性贝类毒素质谱参数列于表4。
1.4样品前处理
样品制备：用清水将贝壳洗净，撬开贝壳，切断闭壳肌，用水淋洗，去除泥沙及异物，仔细取出贝肉，切勿割破贝体，在筛子上平铺沥水5 min，然后将贝肉均质，混匀，–18℃避光保存。对扇贝样品取可食部分进行检测，严禁加热或用麻醉剂开壳。
提取：称取5 g(精确至0.01 g)试样于50 mL离心管中，加入5 mL 1%乙酸水溶液，涡旋90 s，将离心管密封置于102℃烘箱，10 min后取出，流水冷却至室温，以4 500 r/min离心10 min，待净化。
净化：移取上清液1 mL于2 mL离心管中，加入5μL氨水，涡旋混匀。取250 μL提取液，上样到用3 mL 20%乙腈水溶液(含0.8%乙酸)、3 mL 0.1%氨水溶液活化后的supelco ENVI–Carb固相萃取柱，待流干后以700 μL超纯水淋洗，正压挤干，弃去所有流出液，最后以2 mL 20%乙腈水溶液(含0.8%乙酸)洗脱，正压挤干，将洗脱液全部收集于5 mL离心管中，混匀，过0.22 μm滤膜后待测。
2结果与讨论
2.4标准工作曲线与检出限
在1.3仪器工作条件下，对表2中的系列混合标准工作溶液分别进样测定，以待测化合物的峰面积(Y )为纵坐标，以其质量浓度(X )为横坐标进行线性回归，得线性回归方程及相关系数。以3倍信噪比对应的浓度作为方法检出限。10种麻痹性贝类毒素的线性方程、相关系数和检出限列于表5。由表5可知，10种麻痹性贝类毒素的质量浓度在4～240 μg/L与对应的色谱峰面积线性关系良好，相关系数大于0.99，检出限为8~28 μg/kg。
2.5加标回收与精密度试验
准确称取6份混合均匀的阴性样品5.0 g作为本底，加入适量麻痹性贝类毒素标准样品进行加标回收试验。按1.4方法进行样品处理，然后上机测定，结果列于表6。由表6可知，10种麻痹性贝类毒素的平均回收率为82.5%～115.1%，相对标准偏差为0.6%～7.5%(n=6)，说明方法的精密度和准确度良好。10种麻痹性贝类毒素混合标准溶液的总离子流图见图5。
3 结语
采用超高液相色谱–串联质谱法测定水产品中10种麻痹性贝类毒素，用甲酸溶液对样品进行加热提取，应用石墨化炭黑固相萃取柱对其亲水基质进行净化。相比于其它方法，该方法对极难去除的亲水杂质进行针对性处理，通过考察提取液性质、提取温度、净化液性质和有效上样量，优化了提取净化条件，取得了理想的净化效果，提高了方法检测灵敏度和精确度。
引用格式
冯静，陈曦，邹淼，等.超高效液相色谱–串联质谱法测定水产中10种麻痹性贝类毒素［J］.化学分析计量，，28(4): 42–47.
FENG J，CHEN X，ZOU M，et al. Determination of 10 paralytic shellfish toxin (PSTs) by ultra performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry［J］. Chemical analysis and meterage，，28(4): 42–47.
内容/化学计量分析
编辑/食典报
