近期，国际权威期刊《细胞·干细胞》（Cell Stem Cell，IF=21.46）在线发表了《Human Reproduction Update中文版》编委、中南大学林戈教授课题组、深圳华大生命科学研究院徐凤萍博士课题组与中国医学科学院蒋太交教授课题组共同合作的一项最新研究成果（Single-cell transcriptome analysis of uniparental embryos reveals parent-of-origin effects on human preimplantation development）。该研究首次绘制了人类单亲和双亲胚胎着床前发育时期的转录组和DNA甲基化图谱，并鉴定出1388个父母源基因组倾向性表达基因，阐释了父母源基因组对着床前胚胎基因组激活和细胞分化的作用，为早期胚胎发育异常的溯源分析提供了理论依据。
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聚焦问题 凝练方向
人类胚胎发育起始于精卵结合，受精卵经过多次卵裂发育为由内细胞团和滋养层细胞组成的囊胚。体外受精胚胎的囊胚形成率约为40%~50%，大部分胚胎阻滞在4~8细胞阶段。目前对胚胎发育阻滞的原因已有一定的认识，其中一个明确的因素是染色体不稳定，有研究发现在早期阻滞胚胎中存在大量的染色体异常；另一个重要的因素是胚胎基因组激活（Embryonic Genome Activation，EGA）障碍，在整个植入前发育过程中，EGA的成功活化是囊胚发育所必需的。
近年来，单细胞水平的基因表达分析平台的建立解决了以往对研究材料的限制，使深入系统地研究早期胚胎发育生物学领域中重大而关键的科学问题成为可能。，乔杰院士团队（PMID：23934149）和范国平教授团队（PMID：23892778 ）同时发现人类植入前胚胎受精卵阶段有一个minor EGA，这时期会有少量基因激活，而major EGA发生在4~8细胞阶段。前期，我们利用染色质开放区域和转录组平行测序技术（LiCAT-seq），发现人类着床前胚胎2~4细胞期就已建立起EGA特异的染色质开放区域，并且精子和早期胚胎具有完全不同的染色质开放区域（PMID：30664750 ），因此，我们推测父母源基因组在EGA的准备和激活过程中可能发挥不同的作用。基于此，项目组以孤雌（parthenogenetic，PG）、孤雄（androgenetic，AG）和正常受精（biparental，BI）胚胎为模型，结合胚胎延时成像和单细胞多组学技术，系统地研究父母源基因组对早期胚胎发育的影响。
02
缜密设计层层推进
通过形态学观察，我们发现相比于双亲胚胎，单亲胚胎的发育潜能显著降低，异常分裂行为的发生率显著升高，并且单亲和双亲胚胎的发育速度出现明显差异，孤雄胚胎发育较快，孤雌胚胎发育较慢。
图1 单亲和双亲胚胎的行为学和动力学特征
为了进一步观察父母源基因组对胚胎细胞分化的影响，项目组将三组胚胎培养至囊胚，发现相较于双亲胚胎能够形成滋养细胞层和内细胞团分化良好的囊腔，孤雌和孤雄囊胚的细胞分化均存在部分缺陷。孤雄囊胚未见明显的内细胞团，孤雌囊胚的滋养层细胞发育受限。
图2 单亲和双亲囊胚的细胞分化潜能
在确定了单亲胚胎在植入前发育阶段就已经表现出明显的发育异常后，项目组接下来利用单细胞转录组测序方法，从基因表达层面解析单亲和双亲胚胎的表型差异。考虑到异常分裂行为会影响胚胎的基因表达，我们首先通过胚胎延时成像技术筛选分裂行为正常的胚胎用于单细胞转录组测序。结果显示三类胚胎major EGA均发生在4细胞至桑椹胚时期，但是单亲胚胎表现出EGA激活程度下降和母源性物质清除不完全。
图3 单亲和双亲胚胎的基因表达动态变化
通过单亲和双亲胚胎的基因表达差异分析共鉴定出807个母源基因组倾向性表达的基因（maternally-biased expressed genes，MBGs）和581个父源基因组倾向性表达的基因（paternally-biased expressed genes，PBGs）。并且MBGs在4细胞阶段开始表达，其功能可能对起始EGA过程有重要贡献。PBGs倾向于8细胞时期开始表达，其功能与胚胎紧密化和滋养层细胞分化密切相关，从分子水平印证了单亲和双亲胚胎的表型差异。
图4 MBGs和PBGs的鉴定及功能
为了进一步揭示MBGs和PBGs在人类着床前胚胎的调控机制，我们首先对MBGs和PBGs进行了转录因子调控网络分析，发现MBGs的表达可能受DUX4、EGR2和DUXA等核心转录因子调控，PBGs可能受ZNF263和KLF3等核心转录因子调控。
图5 MBGs和PBGs的转录调控网络
鉴于甲基化水平对于基因表达的影响，我们进而分析了MBGs和PBGs在三类胚胎的DNA甲基化状态，发现PBGs的表达与父母源基因组特异性的DNA甲基化密切相关。以上结果证实转录因子和DNA甲基化共同参与调控早期胚胎MBGs和PBGs的表达。
图6 MBGs和PBGs的DNA甲基化状态
03
砥砺前行终有收获
本研究巧妙地利用了孤雌和孤雄单亲胚胎模型来探讨父母源基因组对早期胚胎发育的贡献。结果系统全面地绘制了人类着床前胚胎的父母源基因组调控网络，对于认识早期胚胎发育及调控机制具有重要价值。同时，我们也发现父母源基因组在早期胚胎发育过程中具有各自特异的功能。母源基因组对起始EGA过程有重要贡献，而父源基因组与胚胎紧密化和滋养层细胞分化密切相关，这为临床上阻滞胚胎的精子或卵子因素的溯源分析提供了新的思路。
由于研究内容与发育生物学密切相关，我们选择投稿到《细胞·干细胞》杂志。在审稿过程中，主编与审稿人对我们的研究表示出了浓厚的兴趣，认为我们的研究提供了关于人类胚胎发育方面前所未有的新见解。同时，有2位评审建议增加样本量，并且尝试解释早期胚胎父母源效应的表观遗传机制。在补充大量实验、反复修改和讨论后，论文于10月3日在线发表。
04
持续创新服务临床
今后，我们将对鉴定的关键MBGs和PBGs在早期胚胎发育过程中的具体功能及作用机制进行深入研究，进一步完善早期胚胎发育的父母源基因组调控网络。同时，收集临床上不同类型的阻滞胚胎进行MBGs和PBGs的表达分析，筛选阻滞胚胎的精子或卵子相关病因学诊断的分子标记，将精准医疗理念融入辅助生殖领域。
研究团队简介
冷丽智博士（中南大学）、孙继亚博士（中国医学科学院）和黄晋荣博士（深圳华大生命科学研究院）为本文共同第一作者。中南大学林戈研究员、深圳华大生命科学研究院徐凤萍博士和中国医学科学院蒋太交教授为论文共同通讯作者。该研究获得了国家自然科学基金、国家重点研发计划等多个项目的支持，同时该课题得到了国家卫生健康委员会人类干细胞与生殖工程重点实验室、中信湘雅生殖与遗传专科医院等单位的大力协助和支持。
本文由中南大学的冷丽智博士供稿
参考文献
Leng L,Sun J,Huang J,Gong F,Yang L,Zhang S,Yuan X,Fang F,Xu X,Luo Y,Bolund L,Peters BA,Lu G,Jiang T,Xu F,Lin G. Single-cell transcriptome analysis of uniparental embryos reveals parent-of-origin effects on human preimplantation development. Cell Stem Cell. Nov 7;25(5):697-712.e6.doi: 10.1016/j.stem..09.004. Epub Oct 3.
