白念珠菌唑类药物相关耐药基因及其调控机制的研究进展 白念珠菌唑类药物相关耐药基因及其调控机制的研究进展
吴永琴， 应春妹
（复旦大学附属妇产科医院检验科，上海 200011）
摘要：白念珠菌是人体常见的条件致病性真菌。随着唑类抗真菌药物的长期、广泛应用，白念珠菌耐唑类抗真菌药物的临床分离株也逐渐增多，已经成为临床抗白念珠菌治疗的棘手问题。现就白念珠菌唑类药物相关耐药基因及其调控机制进行综述，以便在转录调控层面寻找新的白念珠菌感染的治疗靶点及开发新的抗真菌药物。
关键词：白念珠菌；唑类药物；耐药基因；调控机制
白念珠菌是一种寄居在正常人群口腔黏膜、上呼吸道、肠道及阴道等部位的酵母样真菌，为条件致病性真菌。近年来由于免疫抑制剂和抗菌药物广泛、大量的使用及肿瘤放疗和化疗患者的增多等，白念珠菌感染逐年增加，深部真菌感染的发病率明显上升。氟康唑等唑类抗真菌药物由于良好的生物利用度和生物安全性被广泛用于临床抗真菌治疗，但反复大剂量、长疗程的应用导致了具有多种耐药基因的白念珠菌耐药菌株的产生，这使临床治疗白念珠菌感染变得非常棘手。近年来，白念珠菌耐药基因的转录调控机制有了许多新发现。通过对白念珠菌耐药基因和调控机制的研究有望在转录调控层面找到新的药物治疗靶点，同时为临床诊治提供有效依据。本文就白念珠菌的耐药基因及其调控机制的最新研究进展进行综述。
一、外排泵相关耐药基因及其调控
白念珠菌细胞膜上的外排泵活力增强是白念珠菌对唑类药物耐药的主要机制之一，此机制通过外排药物及减少药物摄入来降低胞内药物浓度，从而导致耐药。有报道显示在临床分离的耐药菌株中，以外排泵形式耐药的菌株占主要部分［1］。介导耐药的外排泵跨膜转运蛋白根据外排机制和能量来源的不同分为2类：拥有ATP结合盒结构（ATP-binding cassette，ABC）的转运蛋白超家族和主要易化载体超家族（major facilitator superfamily，MFS）［2］。
1.CDR1、CDR2基因过度表达和调控机制 外排泵跨膜转运蛋白相关编码基因CDR属于ABC超家族，有CDR1～CDR10共10个基因，但其中只有CDR1和CDR2基因过度表达与唑类药物的耐药有关。CDR1和CDR2基因的过度表达导致外排泵泵出药物能力增强，从而导致白念珠菌对唑类药物耐药［3］。CDR1和CDR2基因的过度表达与基因转录水平调控有关，顺式作用元件发生突变和反式作用因子的量或活性改变都有可能促使ABC超家族外排泵相关基因高表达，见图1。LIU等［4］证实了药物反应元件（drug response element，DRE）是与CDR1和CDR2基因表达上调或持续性高表达相关的顺式作用元件。而由TAC1基因编码的CDR基因转录激活因子1（transcriptional activator of CDR gene 1， Tac1）则与DRE中5"-CGG-3"三联子序列结合，介导CDR1和CDR2基因过度表达，从而使外排泵活性增强导致耐药。TAC1基因具有高度多态性，TAC1基因的功能获得性（gainof-function，GOF）突变可导致CDR1和CDR2基因的过度表达，有文献已经证实了分布于12个不同氨基酸位点的16个GOF突变位点，这些GOF突变大多数位于TAC1基因C末端［5］。随着研究的深入，更多GOF突变被证实，如位于中间同源区域（middle homology region，MHR）的T225A、I255stop、W239L［6］、S264P位点［7］及仅导致CDR2表达上调的R688Q位点［8］，这些GOF突变都拥有促使外排泵活性增强的调控机制，从而导致白念珠菌产生耐药。此外，有学者通过人工激活转录因子的方法获得了新的锌簇转录因子——由MRR2编码的多药耐药调节因子2（multidrug resistance regulator 2，Mrr2），其参与Tac1介导的耐药过程，主要介导CDR1基因高表达导致的耐药［9］。最近WANG等［10］证实了白念珠菌临床分离株中MRR2的GOF突变，特别是S466L和T470N位点突变，可以导致CDR1的过度表达，进一步证实了Mrr2对CDR1基因的调控作用。更多MRR2基因的GOF突变位点有待发现，特别是与耐药基因CDR1过度表达相关的GOF突变。
2.MDR1、FLU1基因过度表达和调控机制 MDR1是白念珠菌MFS成员之一——多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1，Mdr1）的编码基因，MDR1基因的过度表达可以使外排泵活力增强，胞内药物被大量泵出而导致耐药。多药耐药调节因子1（multidrug resistance regulator 1，Mrr1）是调控MDR1基因表达的、重要的锌簇转录因子，由MRR1基因编码。MRR1基因GOF突变可以激活MDR1基因的过度表达，有学者发现MRR1基因13个GOF突变活化MDR1基因从而导致外排泵活性增强［11］。近期MORIO等［12］证实了MRR1基因至少有3个GOF突变位点，即R557K、 K884E和S1037L，能够介导MDR1基因的过度表达，促使外排泵活力增强，从而导致耐药。CHEN等［13］首先报道了转录因子Rep1是MDR1基因的负向调节因子，由外排泵调节基因1（regulator of efflux pump 1，REP1）编码，REP1基因的无效突变导致了白念珠菌对抗真菌药物敏感性降低。最近LO等［14］又报道了新的MDR1基因负向调控念珠菌假菌丝调控因子1（Candida pseudohyphal regulator 1，Cph1）由CPH1基因编码，CPH1的无效突变使有活性的Cph1无法生成，负向调控作用的丧失间接增加MDR1基因的表达量，进而导致白念珠菌对唑类药物耐药。负向调控转录因子的陆续被发现拓展了耐药基因调控机制的研究思路。
图1对唑类药物耐药的白念珠菌外排泵基因调控机制
FLU1基因是白念珠菌MFS另一个多药外排转运蛋白——易化扩散超家族转运蛋白1（facilitator superfamily transporter 1，Flu1）的编码基因，被CALABRESE等［15］首先发现并命名，但与临床分离株唑类药物耐药机制相关性不强。近期XU等［16］就发现FLU1并没有在唑类耐药白念珠菌的临床分离株中过度表达。ZHANG等［17］发现阴道分泌物分离的耐药菌株中FLU1基因的表达情况与敏感株相比差异无统计学意义（P＞0.05）。因此对于FLU1基因与耐药的相关性还有待进一步研究确定。
二、麦角固醇生物合成相关耐药基因及其调控
麦角固醇是维持白念珠菌细胞膜完整性和流动性的重要组成部分，其生物合成所需要的重要酶类由ERGl～ERG27基因编码，其中与耐药相关的基因主要为ERG3和ERG11。在唑类抗真菌药物的压力下，麦角固醇生物功能的替代途径会被激活进而导致耐药，而该途径被激活的关键就是编码甾醇△5，6-去饱和酶的ERG3基因的无效突变［18］。此外，麦角固醇生物合成的关键靶酶——由ERG11基因编码的14α去甲基化酶是唑类药物抗真菌作用的靶点。
1.ERG3、ERG11基因突变与耐药 ERG3基因位于ERG11基因上游，该基因的无效突变导致菌体不能生成有活性的甾醇△5，6-去饱和酶，菌体内麦角甾醇类物质聚集，但集聚的甾醇类物质能够部分替代麦角固醇的功能，并且能够维持菌株的正常生长，从而躲避了抗真菌药物的作用［19］。MARTEL等［20］通过甾醇分析的方法从临床样本中鉴定出4种白念珠菌ERG3 突变体，对氟康唑、伏立康唑、伊曲康唑及酮康唑均表现为耐药。陈晋宇等［21］在2株临床耐药菌株中发现共同的ERG3错义突变位点A351V，并证实其与白念珠菌耐药相关。然而据LIU等［22］报道，在其临床分离的耐药菌株中并没有发现ERG3基因的无效突变。因此对于ERG3基因错义突变与菌株耐药的关系还有待进一步研究。
ERG11基因容易发生突变，但大部分都是同义突变。早在1998年就有学者利用异源性表达酿酒酵母和定点突变技术成功证实错义突变引起的氨基酸置换可以导致白念珠菌对氟康唑的敏感性降低，可能和氟康唑与靶酶结合的亲和力下降有关［23］。有报道显示，ERG11基因的错义突变在临床分离的白念珠菌耐药菌株中普遍存在［24］。据报道在已发现的140个错义突变中，只有部分错义突变被明确证实与耐药有关，而且在大部分已发现的耐药菌株中都含有多个错义突变［25］。FLOWERS等［26］研究发现，ERG11基因某些错义突变位点的产生会使白念珠菌对唑类药物的敏感性发生明显变化，还证实了Y132F、K143R、F145L、S405F、D446E、G448E、F449V、G450E和G464S氨基酸置换位点与白念珠菌对氟康唑的耐药有关。刘锦燕等［27］证实了白念珠菌14α去甲基化酶K143Q位点的氨基酸置换与氟康唑耐药的形成有一定相关性。
2.ERG11基因过度表达和调控机制 ERG11基因过度表达会导致14α去甲基化酶增多，白念珠菌胞内的唑类药物不能够阻止靶酶与羊毛甾醇结合，无法影响麦角固醇的合成，从而导致白念珠菌耐药。这可能与白念珠菌自身调节有关，大量唑类药物与靶酶结合，使麦角固醇合成受到抑制，从而菌体负反馈调节生成更多的靶酶使有足够的靶酶与合成底物结合。UPC2基因编码的Upc2是调节ERG11基因表达的关键锌簇转录因子。在ERG11基因启动子序列上存在一个唑类反应增强子元件（azole-responsive enhancer element，ARE），是Upc2上调ERG11基因表达的必要转录增强元件，Upc2正是与ARE结合后上调ERG11基因表达从而介导耐药的［28］。有研究表明，UPC2基因的GOF突变能够介导ERG11基因的过度表达，而UPC2基因的敲除会使白念珠菌对唑类药物敏感［29］。UPC2基因的GOF突变可导致白念珠菌对唑类药物耐药，据报道转录因子Upc2中的A643V、G648D、G648S和Y642F位点的氨基酸置换与ERG11基因的过度表达有关，而且UPC2基因的GOF突变在临床分离的耐药菌株中普遍存在［30］。随着研究的深入，UPC2基因更多的新的GOF突变位点有待发现，对ERG11基因高表达的调控机制也会有更多的全新认识。
三、生物膜相关耐药基因及其调控
随着生物材料的广泛使用，真菌感染后临床分离株生物膜形成率也不断增多，白念珠菌生物膜形成是其体外药物敏感性试验敏感但临床药物治疗无效的重要原因之一，治疗后病程长且易复发。白念珠菌生物膜耐药机制复杂，目前相关耐药基因也陆续被发现。NOBILE等［31］最早证实菌丝壁蛋白1（hyphal wall protein 1，Hwp1）是白念珠菌体内生物膜形成所必须的物质，Hwp1/ Hwp1突变株较Hwp1/Hwp1重组株生物膜形成能力显著下降，而且HWP1基因的表达受到锌簇转录因子Bcr1的调控。生物膜形成过程中调控机制复杂，有研究表明转录因子Bcr1可以对多种菌丝壁蛋白进行调控［32］。近期CHEN等［33］通过敲除SFP1基因的方法证实转录因子Sfp1可以负向调控黏附蛋白相关编码基因ALS1、ALS3和HWP1，SFP1基因的删除可以增强细胞黏附和生物膜形成，而转录因子Bcr1和Efg1则均具有正向调控作用。生物膜的形成过程与耐药息息相关，针对相关耐药基因抑制性药物的研发有望解决白念珠菌生物膜形成造成的持续性感染难题。生物膜形成后的耐药机制更为复杂，包括β-葡聚糖的隔绝作用，超氧化物歧化酶对活性氧的清除作用，外排泵相关基因CDR1和CDR2的过度表达以及ERG11基因的过度表达［34］。所以生物膜耐药问题的解决应该关注生物膜形成过程中的基因表达调控，而不是生物膜形成后的耐药机制。
综上所述，白念珠菌唑类耐药问题已经成为临床抗白念珠菌治疗的棘手问题，然而白念珠菌对唑类药物的耐药机制复杂，耐药基因较多，临床分离的耐药菌株往往携带多种耐药基因。近期SCHNEIDER等［35］通过杂交锌簇转录因子的研究，将Upc2融合到 Mrr1和Tac1的DNA结合域，发现Upc2可以上调MDR1和CDR2基因的表达，同样Tac1也能上调MDR1和ERG11基因的表达。这使我们认识到一种转录因子可能调控多种耐药基因，那么转录调控水平的药物靶点可能会给目前的耐药问题带来希望。耐药基因的调控在白念珠菌耐药机制中发挥主要作用，各种耐药基因的转录调控机制又形成了转录调控网络。随着转录调控网络这幅蓝图的不断绘制，众多耐药基因连成一体，可以让我们更深刻地认识白念珠菌耐药机制，同时有望在转录调控层面寻找新的药物治疗靶点。因此，各种转录因子和耐药基因的交错联系、耐药基因的多重调控及转录因子抑制剂的研发，可能会成为今后的研究热点。
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Drug resistance genes of Candida albicans to azoles and their regulation mechanisms
WU Yongqin，YING Chunmei.
（Department of Clinical Laboratory，Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University，Shanghai 200011，China）
Abstract：Candida albicans is a conditionally pathogenic fungus in human. With azoles being widely applied for a long time，the clinical isolates of Candida albicans against azoles gradually increase. The clinical treatment of Candida albicans has become a thorny issue. The drug resistance genes of Candida albicans and regulation mechanisms are reviewed for finding new therapeutic targets and developing new antifungal agents at the level of transcriptional regulation.
Key words：Candida albicans；Azoles；Drug resistance genes；Regulation mechanisms
文章编号：1673-8640（）09-0739-05
中图分类号：R379.4
文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1673-8640..09.002
（收稿日期：-01-31）
（本文编辑：姜 敏）
基金项目：上海申康医院发展中心市级医院临床辅助科室能力建设项目（SHDC）
作者简介：吴永琴，男，1991年生，学士，主要从事病原菌的分子耐药机制研究。
通讯作者：应春妹，联系电话：021-63455050。
