光遗传学是利用光控制细胞过程的遗传方法。它提供了对生物信号和代谢过程的时空、定量和可逆控制，克服了化学诱导系统的局限性。然而，光遗传学在植物研究中滞后，因为生长所需的环境光导致了不期望的系统激活。通过开发植物可用光开关元件(PULSE)解决了这个问题，这是一种在环境光下可逆地控制植物基因表达的光遗传学工具。脉冲结合了一个蓝光调节的阻遏器和一个红光感应开关。基因表达仅在红光下激活，在白光或黑暗下不活跃。在定量数学模型的支持下，对原生质体中的脉冲进行了表征，并获得了较高的诱导率。将其与基于crispr-cas9的技术结合，以靶向合成信号和发育途径。利用脉冲控制植物叶片的免疫应答，制备拟南芥转基因植株。PULSE为植物研究和生物技术开辟了广阔的实验途径。6月30日，国际学术期刊Nature Methods在线报道了德国德国Dusseldorf大学Matias D Zurbriggen教授的题为“Optogenetic control of gene expression in plants in the presence of ambient white light”的研究论文。通过开发植物可用光开关元件(PULSE)，可逆地控制植物基因表达的光遗传学工具，使基因表达仅在红光下激活，在白光或黑暗下不活跃。PULSE为植物研究和生物技术开辟了广阔的实验途径。光遗传学是利用光控制细胞过程的遗传方法。它提供了对生物信号和代谢过程的时空、定量和可逆控制，克服了化学诱导系统的局限性。尽管植物研究中需要类似的方法，但是光遗传学的使用受到植物对广谱光的内在需求的限制，而广谱光会错误地激活光敏开关。Matias D Zurbriggen课题组最近开发了两种用于控制植物细胞中基因表达的光遗传学系统。该系统由红光和绿光调节，已将其用于激素信号通路的定量操作和重组蛋白表达的控制。但是，由于光谱兼容性的局限性以及对整株植物难以实施辅助因子的需求，这些工具只能用于瞬时转化的植物细胞，例如烟草或拟南芥的叶肉原生质体，以及苔藓小菜蛾，可以在光遗传学实验之前保持在黑暗中。尽管这些工具可用于细胞培养中的瞬时信号传导研究，但仍然需要一种光遗传学工具，该工具在整个植物中都起作用，并且对广谱白光不敏感，以在植物中能发挥光遗传学的全部潜力。PULSE是一个集成的光遗传学分子工具，由两个两个工程光感受器组成：一个光感受器，基于植物色素B（PhyB）–PIF6光电开关，保证在红光（Ron）下激活基因表达，另一个光感受器确保在蓝光下（Boff）有效的转录抑制，由EL222光感受器改造而成（图1）。这种方法背后的原理是，两个开关的组合将产生一个在环境生长条件（明暗）下不起作用的系统，并且仅在红光照射下才起作用。这使得能够完全适用于在标准光照条件下生长的植物。
PULSE是一种光遗传系统，用于控制在标准明暗循环下生长的植物的基因表达PULSE功能模式背后的基本原理是，在存在单色蓝光或白光（环境光中存在蓝，绿，红和远红波长的组合）的情况下，两个感光器PhyB和EL222都主要存在于活性形式，因此与POpto结合。在最小启动子附近募集转录激活因子和阻遏蛋白的最终结果将使系统处于关闭状态。该系统还将在黑暗和远红灯条件下关闭，因为在这些条件下红灯开关将变为非活动状态。在任何其他缺少蓝光成分的照明条件下，SRDX–EL222都无法结合POpto，从而抑制转录。然后，系统在用单色红光处理后处于“开启”状态，PhyB和PIF6之间的相互作用导致激活结构域募集到最小启动子，从而诱导基因表达（图3）。
为了定量了解PULSE的动力学和功能特性，并指导有关最佳光质量，强度和持续时间的未来应用的实验要求，作者开发了基于普通微分方程（ODE）的定量数学模型。为了参数化该模型，通过监测FLuc蛋白和信使RNA水平对原生质体中的PULSE系统进行了开关动力学研究，实验证明了系统的可逆性。为了进一步表征蛋白质生产的时间阈值和光强度阈值，收集了终点测量值并进行了剂量响应实验。使用参数化模型来预测系统的实验基因表达结果，该结果是不同光强度，波长和照明时间的函数。基于对PULSE动态行为的仿真生成了热图，这将指导目标条件的选择，以获得感兴趣的指定表达水平，从而有助于实验设计。为了说明这一点，我们测试了从热图中选择的红光强度和照明持续时间的组合。观察到了预测活动和实验确定活动之间的强烈对应关系。这表明该模型适用于确定通过PULSE严格控制基因表达水平所需的实验条件。重点应用来了：定制了PULSE，以实现对来自任何给定目的启动子的基因表达的定量和时间分辨控制。作者设计了两种方法，诱导CRISPR–Cas9衍生的基因激活剂的合成或内源性TF的表达。这些转录激活因子继而激活靶标正交启动子或拟南芥启动子的表达。为了实现对任何目标启动子的光遗传学和可定制的控制，使用了PULSE来控制融合至强激活域（称为dCas9–TV）的核酸酶缺陷型化脓性链球菌Cas9蛋白的表达。在拟南芥原生质体的第一个实例中，PULSE诱导的dCas9–TV驱动了正交启动子，即茄属双氢黄酮醇4-还原酶启动子（PSlDFR）的表达，而FLuc作为定量读数（图4a）。为了靶向启动子，使用了相对于PSlDF转录起始位点（TSS）的–150个碱基对区域的引导RNA。由PULSE控制的dCas9-TV仅在红光照射下才激活启动子，从而实现表达诱导，分别比蓝光和黑暗时高24.5倍和40倍（图4b）。dCas9–TV的组成型表达作为阳性对照，相对于没有dCas9–TV的构型，产生了具有105.1倍诱导的PSlDFR的最大激活能力。
拟南芥原生质体中Cas9衍生基因激活剂（dCas9–TV）和拟南芥转录因子（LFY）的PULSE控制表达在植物中用PULSE光遗传控制基因表达：接下来，评估了植物中PULSE的功能。我们构建了一组通过根癌农杆菌转化的载体，其中含有二元质粒中的所有必需成分。载体包含在PULSE（POpto）的控制下的报告基因，在组成型启动子（PCaMV35S或PAtUbi10）下表达的PULSE，以及任选地组成型表达的报告基因作为归一化元件和植物选择模块。用含有PULSE的构建体瞬时转化了本氏烟草叶，该荧光蛋白基因作为报告基因（与组蛋白H2B融合的维纳斯用于核定位，POpto–Venus-H2B组成型表达，与核定位序列（NLS）融合的天蓝蛋白标准化元素。用红光处理后，植物的核维纳斯/蔚蓝荧光比率随时间增加，在9小时后诱导达到28.7倍，并在蓝，暗和白光下保持背景水平，从而证明了植物体内系统的激活（图5）。
图5：Implementation and characterization of PULSE in N. benthamianaleaves.
随后，作者又利用该系统，通过引入异源模式识别受体来允许产生具有免疫能力的叶表皮细胞。结果表明，PULSE可用于以时间控制的方式在植物中诱导生理反应。稳定拟南芥转基因品系中的PULSE功能为了测试整个植物中PULSE的功能，在PCaMV35S启动子的控制下使用编码PULSE的质粒，并以POpto-FLuc作为报告基因，生成了转基因拟南芥品系。在用萤光素孵育之前，我们在多孔板上培养了纯合T3植物的幼苗7 d。我们对板进行了不同的光处理后的发光进行了定量（图6e）。两条独立的PULSE转基因株系说明了该系统的功能，其激活水平分别为10倍至21倍。并且，在从白光到红光的转移下，会导致表达的激活；当将植物移回白光时，系统关闭失活（图6e），证明了系统的可逆性。该实验表明，PULSE可以控制整个植物中的基因表达，为植物研究和生物技术打开了机会。
图6：In planta optogenetic heterologous induction of immunity and conditional subcellular targeting of receptors, and PULSE functionality in Arabidopsistransgenic lines.
在未来，PULSE将促进有针对性的操纵和研究植物的生物学过程，包括发育，生长，激素信号传导和胁迫反应。原文链接：/articles/s41592-020-0868-y#ref-CR8
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