本文原载于《中华眼科杂志》第5期
白内障是葡萄膜炎最常见的并发症，18%~35%的葡萄膜炎发生并发性白内障，是造成葡萄膜炎患者视力损害的重要原因之一[1,2]。葡萄膜炎并发性白内障的成因普遍认为是眼内存在炎性反应刺激时炎症细胞沉积于晶状体囊膜影响其通透性、房水成分受炎性反应影响改变晶状体代谢以及糖皮质激素的使用。近年来越来越多的学者认为晶状体上皮细胞与白内障形成密切相关，上皮细胞凋亡[3]、DNA损伤及内质网应激[4,5]、氧化应激[6,7,8]都被认为参与白内障的形成。葡萄膜炎并发性白内障患眼在白内障术后发生后囊膜混浊（posterior capsule opacification，PCO）的概率较年龄相关性白内障患者高[9]。晶状体上皮细胞仅存在于晶状体前囊下及赤道部，前囊由晶状体上皮细胞分泌，上皮细胞通过紧密连接附着于前囊之上，而前囊另一面即前表面与房水接触，晶状体前囊下上皮细胞靠近前房，成为葡萄膜炎前房炎症首先容易影响的部位，并发白内障因而发生。本研究通过对比葡萄膜炎并发性白内障与年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜细胞电镜特点，探讨影响葡萄膜炎并发性白内障及术后PCO发生的可能因素。
对象与方法
一、对象
本研究为横断面研究，选取8月至3月于北京大学第一医院眼科行白内障超声乳化手术的10例（10只眼）患者术中撕囊获得的晶状体前囊。10例患者中，不同病因的葡萄膜炎患者7例（7只眼）（系统性红斑狼疮1例、Vogt-小柳原田病1例、类风湿关节炎1例、特发性葡萄膜炎4例），年龄（49±20）岁，其中前葡萄膜炎5例，全葡萄膜炎2例（表1）；年龄相关性白内障3例（3只眼），均为女性，年龄分别为54、71、74岁，白内障类型分别为皮质性、核性、皮质性。葡萄膜炎分类根据标准葡萄膜炎命名工作组（standardized uveitis nomenclature，SUN）制定标准，白内障按照晶状体混浊部位分为皮质性、核性、后囊膜下性以及全白内障。在手术前所有葡萄膜炎患眼炎性反应安静期均>3个月。本研究方案获得北京大学第一医院伦理委员会批准（[1325]），患者均签署知情同意书。
二、方法
1．标本处理：
术中获得的晶状体前囊均立即放入0.2 mol/L磷酸缓冲液配制的3%戊二醛固定液中（培养细胞需用1.5%戊二醛固定液），4 ℃保存2 h以上；标本按编号顺序依次放入8格标本栏中，标本栏中加入0.1 mol/L蔗糖缓冲液30 min，洗涤2遍，第3遍蔗糖缓冲液4 ℃过夜。后经1%锇酸12 ml固定2 h后常规脱水、包埋，超薄切片机切片（70~90 nm），醋酸双氧铀和枸橼酸铅进行双染色。
2．电镜观察:
主要观察前囊膜上皮细胞，每份标本至少观察36个细胞，观察并记录其细胞形态、细胞与囊膜连接处、细胞之间连接、细胞核、细胞器（例如线粒体、内质网以及自噬小体）等结构，1名对样本来源及诊断未知的眼科临床医师观察标本形态并记录下异常。按照细胞核密度分为核质均匀、染色质密度增大、核固缩、核碎裂；将核固缩看作细胞凋亡标志，将细胞分为凋亡、非凋亡；按照细胞核形态将其分为圆形、梭形；细胞间连接及细胞器异常根据其严重程度分为轻度、中度、重度。
三、统计学分析方法
数据分析使用SPSS 20.0软件，正态分布的数据采用
±s表示，非正态分布的数据采用中位数（范围）表示。利用线性回归分析葡萄膜炎持续总时间与细胞核异常、细胞凋亡的相关性。以P<0.05为差异有统计学意义。
结果
一、上皮细胞排列
7例（7只眼）葡萄膜炎并发性白内障患者晶状体前囊膜都可见上皮细胞极性消失，所有细胞（100%）均呈梭形；4例（4只眼）患者晶状体前囊膜上皮可见双层至多层排列。3例（3只眼）年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞中分别有72.00%、83.33%、83.33%的细胞存在极性，呈柱状形态；28.00%、16.67%、16.67%的细胞呈梭形（图1）。
二、细胞连接
葡萄膜炎并发性白内障和年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜上皮-囊膜连接处均可见不同程度的异常，具体表现为细胞内空泡、上皮细胞与囊膜间空隙。葡萄膜炎并发性白内障患者上皮-囊膜连接处重度异常，表现为大多数细胞均可观察到空泡与间隙，上皮-囊膜处连接结构紊乱，并且可于部分细胞内观察到前囊膜组织嵌入；而年龄相关性白内障患者上皮-囊膜连接轻度异常（3例3只眼），表现为上皮与囊膜连接大体结构存在，局部出现液泡。葡萄膜炎并发性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞之间紧密连接呈波浪状，相互嵌入；而年龄相关性白内障患者上皮细胞间紧密连接规则，呈垂直于囊膜的竖线形（图2）。
三、细胞核
葡萄膜炎并发性白内障患者前囊膜上皮细胞细胞核呈梭状或星状，异质性增大，核质密度增大（图3），核质正常的上皮细胞比例仅为8.33%（0~16.67%），染色质密度增加的细胞比例为47.07%±22.28%，核固缩细胞比例为38.02%±19.61%，核碎裂细胞比例为9.96%±8.10%，并且葡萄膜炎持续总时长与细胞核正常比例呈弱负相关（r=-0.744，P=0.05，图4）。而3例（3只眼）年龄相关性白内障患者中绝大多数细胞（72.00%、83.33%、83.33%）细胞核圆，形态规则，核质正常的细胞比例分别为50.00%、75.00%、58.33%，染色质密度增加的细胞比例分别为50.00%、16.67%、41.67%，核固缩细胞比例分别为0、8.33%、0，未观察到核碎裂细胞（图3）。
四、细胞器
葡萄膜炎并发性白内障患者中，5例（5只眼）观察到晶状体前囊膜上皮细胞内线粒体严重肿胀，2例（2只眼）线粒体中度肿胀，内质网结构破坏，此外还可观察到细胞质密度加深；而年龄相关性白内障患者仅观察到轻度（3只眼）线粒体肿胀，内质网结构清晰，细胞质密度均一（图5）。
五、细胞凋亡
葡萄膜炎并发性白内障患者晶状体前囊膜上皮中凋亡细胞占全部细胞比例平均为48.16%±26.66%，年龄相关性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞中凋亡细胞比例分别仅为0、8.33%、0。在葡萄膜炎并发性白内障患者中，葡萄膜炎持续总时间与凋亡细胞比例呈弱正相关（r=0.750，P=0.05，图6）；而患者年龄与凋亡细胞比例无相关性（P=0.27）。
六、自噬小体
在2例（2只眼）年龄相关性白内障患者的上皮细胞内可观察到少量典型自噬小体（图7），而在葡萄膜炎并发性白内障患者中未观察到典型自噬小体。
讨论
葡萄膜炎并发性白内障的发生是多种因素的协同作用。本研究观察了炎性反应状态下晶状体前囊膜上皮细胞的形态改变。在本研究观察的所有晶状体前囊标本中均有不同程度的细胞内液泡、空隙、线粒体肿胀等超微结构改变，这些异常通常被认为可由氧化应激引起，且与白内障严重程度相关[10]。葡萄膜炎并发性白内障和年龄相关性白内障晶状体前囊膜上皮细胞均存在氧化应激损伤。这与以往对晶状体上皮细胞的观察研究结果相符，氧化应激损伤可出现于糖尿病并发性白内障、高度近视眼并发性白内障以及年龄相关性白内障中，类型包括核性、皮质性、后囊膜下性[11]。葡萄膜炎并发性白内障晶状体前囊膜上皮细胞线粒体肿胀较重，液泡、空隙较年龄相关性白内障明显，表明葡萄膜炎并发性白内障晶状体前囊膜上皮细胞经受更多氧化应激刺激，不仅影响上皮细胞功能，导致晶状体代谢异常，而且成为晶状体前囊膜上皮细胞凋亡的重要诱因。
以往研究表明，年龄相关性白内障晶状体上皮中存在低水平的细胞凋亡[12]。造成晶状体上皮细胞凋亡的主要机制为氧化应激损伤与基因损伤，由p53依赖的凋亡通路介导[13]。本研究观察到葡萄膜炎并发性白内障晶状体前囊膜上皮凋亡细胞所占比例较年龄相关性白内障大，且凋亡细胞占比与炎性反应总时间呈正相关。由此可推论，葡萄膜炎并发性白内障由于长期炎性反应刺激，处于更富于氧自由基环境下，因此造成DNA损伤更严重；当损伤超过上皮细胞修复限度时即启动凋亡程序。在最新的流行病学调查中显示，葡萄膜炎发作频率与慢性炎性反应为葡萄膜炎并发性白内障发生的危险因素[14]，从一定程度上验证了本研究结果，但由于缺乏合适对照，本研究尚无法比较炎性反应持续时间相同的慢性与复发性葡萄膜炎患者的凋亡细胞比例。
梭形、星形细胞核常见于葡萄膜炎并发性白内障中，并且在葡萄膜炎并发性白内障组中可见全部细胞核梭形变。相应地，葡萄膜炎并发性白内障组中上皮细胞形态也呈梭形改变，细胞间连接相互嵌叉，上皮多层化，这一点与文献中观察到的现象吻合[10]。细胞形态梭形变，被认为是晶状体上皮细胞发生了上皮-间叶细胞转换（epithelial-mesenchymal transform，EMT）所导致[15]。EMT过程是当上皮完整性被破坏后上皮细胞迁移，细胞形态由上皮细胞变为中胚层间叶细胞的过程，葡萄膜炎患眼中存在的多种炎症因子如肿瘤生长因子β（tumor growth factor β，TGF-β）、胰岛素样生长因子、表皮生长因子均可诱导EMT发生[16,17]。EMT主要表现为上皮细胞失去极性，变为纺锤状，表达中胚层间叶细胞特征性α-平滑肌动蛋白，而上皮细胞标志物如E-钙黏蛋白减少[15]。过度紫外线、炎性反应的存在刺激晶状体赤道部上皮细胞迁移至病变部位后增生，这一过程被认为是后囊膜下性白内障形成的中间环节[15]。因此，亦可以解释并发性白内障多为后囊膜下性混浊。通过TGF-β抑制剂（如Spry）已能够抑制EMT过程，这一理论或许将被运用于葡萄膜炎并发性白内障的预防中[15]。此外，白内障摘除手术后PCO被认为是残留晶状体上皮细胞迁移增殖导致，葡萄膜炎并发性白内障摘除手术后PCO发生较年龄相关性白内障早，发生率较高，尤其在儿童葡萄膜炎患者中，EMT过程的发生在其中可能起到重要作用。
细胞自噬是细胞通过溶酶体吞噬自体细胞质中某些部分的过程，是维持细胞稳态的重要机制。在细胞遭受应激时自噬发生增加，以帮助细胞渡过应激阶段。自噬过程在眼部广泛存在，在维持晶状体透明性中起到重要作用[18]。晶状体的透明性取决于晶状体上皮细胞、未成熟晶状体纤维细胞中的线粒体活性以及晶状体纤维成熟过程中细胞器程序性丢失的过程。晶状体上皮细胞及未成熟纤维细胞中线粒体功能异常将导致白内障的发生，而自噬被认为可以通过降解异常线粒体，保护线粒体正常活性，抑制白内障的发生[19]。以往研究结果表明，在发生白内障的晶状体中，自噬过程可能被抑制，最终导致晶状体透明度下降[20]。而在葡萄膜炎发病过程，自噬过程被抑制可诱导葡萄膜炎的形成[21]。本研究观察到，在年龄相关性白内障患者晶状体上皮细胞中存在典型自噬小体，而7例葡萄膜炎并发性白内障患者晶状体前囊膜上皮细胞中均未观察到自噬小体，造成这一现象的可能原因是发生白内障的晶状体前囊膜上皮中自噬普遍被抑制，而葡萄膜炎患眼由于炎性反应存在，氧化应激压力进一步增加，自噬过程抑制程度加重，细胞转入凋亡程序。
综上所述，葡萄膜炎相关性白内障晶状体前囊膜上皮细胞超微结构的改变与眼内炎性反应有关，炎性反应刺激使氧化应激加重，导致凋亡细胞增加；炎症因子作用使上皮细胞向间叶细胞转化，影响正常晶状体纤维形成过程，并且更容易产生PCO；自噬过程被抑制使细胞失去保护机制，促进细胞进一步损伤。当然本研究是一个小样本的探讨，可以为将来的葡萄膜炎并发性白内障的发生提供一些线索和基础，将来需要进一步增加样本量，并对前囊膜上皮细胞的异常与后发性白内障发生的相关性做更深一步的研究探讨。
参考文献
