联合应用蛋白组与代谢组学技术研究三种曲霉在普洱熟茶发酵中的作用与机制
Food Chemistry
●成果介绍
背景
普洱熟茶（Post-fermented Pu-erh tea，Pu-erh Shucha)是一种着名的传统中国茶，它以云南大叶种晒青茶为原料，在高湿环境下通过自然接菌发酵（后发酵）加工而成。普洱熟茶具有滋味醇和、陈香显着、汤色红褐等独特品质。体外、体内和临床研究表明普洱熟茶还具有降血脂、降糖、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗炎抗病毒等活性。最近研究发现，普洱熟茶可以保护神经系统、调节肠道菌群与胆汁酸代谢。
后发酵是普洱熟茶加工的关键环节，在该过程，晒青茶在高湿环境下堆放数星期，导致茶叶成分发生氧化、缩合和降解。目前，普洱熟茶的发酵没有使用发酵剂，原料与环境也未灭菌，因此普洱熟茶发酵中存在曲霉、根霉、青霉、酵母等多种微生物。其中，无论是免培养和纯培养研究结果均显示曲霉是普洱熟茶发酵和产品中的优势菌，因此，曲霉在普洱熟茶发酵中的作用得到了关注。已有研究报道，普洱茶分离的塔宾曲霉（Aspergillus tubingensis）、温特曲霉（Aspergillus Wentii）和烟曲霉（Aspergillus fumigatus）产生洛伐他汀；曲霉可以转化多分形成茶褐素；发酵中黑曲霉分别转化儿茶素/表儿茶素/茶氨酸、表没食子儿茶素/没食子儿茶素/茶氨酸形成Puerins I–IV和 puerins V–VIII；课题组前期发现发酵中黑曲霉和溜曲霉转化形成Teadenol A；另外，普洱熟茶发酵中分离的聚多曲霉和黑曲霉降解咖啡因。总的来说，作为发酵优势菌，曲霉参与普洱熟茶风味与活性物质的形成，然而曲霉在发酵中的具体作用与机制需要进一步研究。
曲霉分布广泛，对于医学、应用和基础研究都具有重要的意义。一些曲霉广泛应用于食品发酵，和大规模生产酶、有机酸以及一些生物活性物质。曲霉能够高效产生很多胞外酶，并用来商业生产纤维素酶、果胶酶、淀粉酶，这些酶可以降解多糖，广泛应用于食品加工。之前报道，课题组发现曲霉不仅是普洱熟茶发酵优势菌也是鉴定到酶的主要产生菌，检测到了174个曲霉产生的蛋白。因此，本文提出假说认为，曲霉在发酵中产生酶，酶催化茶叶成分变化，形成了普洱熟茶的独特品质以及生物活性。为了验证该假说，本文应用从普洱茶发酵中分离的黑曲霉、溜曲霉和烟曲霉单菌发酵茶叶，应用代谢组分析发酵过程代谢物的变化，应用蛋白组研究真菌在茶叶发酵中产生的酶，并进行GO、KEGG和碳水化合物活性酶注释，以探究导致茶叶糖类和酚类物质代谢的酶。相关研究发表在“Food Chemistry”334 () 127560。
结果
代谢组结果概览
主成分分析显示，质控样本聚在一起，表明代谢组分析的稳定性和重现性好，曲霉发酵样品(Asn, Ast and Asf) 与未接菌样品聚成不同的簇，表明发酵改变了茶叶成分。烟曲霉和溜曲霉聚在一起，而与黑曲霉发酵样品分离。一共鉴定到281个含量显着变化代谢物，如没食子酸、槲皮素等。从大类来看，差异变化代谢物可以分为脂类物质(108 个)、苯丙素和聚酮类物质 (76个)、苯类(22个)、有机氧化物 (22个)、有机酸(21个)等。
蛋白组结果概览
每次重复实验中鉴定到493-1632个蛋白，一共在Asn, Asf 和Ast鉴定到 2035、2210、1095个蛋白。分别进行了GO、KEGG注释。6个属于脂代谢的KEGG 代谢途径显着富集，如α-linolenic acid metabolism (ko00592), glycerophospholipid metabolism (ko00564), glycerolipid metabolism (ko00561), synthesis and degradation of ketone bodies (ko00072), fatty acid degradation (ko00071) and fatty acid biosynthesis (ko00061)，可以解释代谢组发现的甘油磷脂、脂肪酸、甘油酯、甾醇脂等脂类物质的变化。另外，属于氨基酸代谢和其它氨基酸代谢的KEGG代谢途径富集，可能导致代谢组发现的氨基酸、肽等物质的变化。总的来说，主要鉴定的蛋白功能为细胞过程与代谢，富集到代谢途径，这些酶支撑真菌的生长与繁殖，导致茶叶脂类、氨基酸等初级代谢物的变化。
碳水化合物活性酶与茶叶糖类物质代谢
碳水化合物活性酶是一大类很重要的酶，具有降解、修饰及生成糖苷键的功能。主要包括糖苷键合成的糖基转移酶（GT），降解的糖苷水解酶（GH）、多糖裂解酶（PLs）和糖酯酶（CEs），辅助活性酶（AA）以及糖基识别的结合模块（CBM）。本蛋白组研究在Asn、Asf和Ast中鉴定到232、225和226酶，分别注释到碳水化合物酶数据库中的103、86、97词条，包括了上述6个类别。
通过代谢组学分析，共鉴定出50种糖苷类化合物，大多数是葡萄糖苷（22种代谢物）、葡萄糖醛酸苷（7种代谢物），和吡喃葡萄糖苷（5种代谢物）。与CK相比，Asn、Ast和Asf中9种、26种和22种糖苷的相对含量降低 (VIP > 1.0,p < 0.05 and FC < 0.66)，而13、19和15个代谢物增加（VIP>1.0，p<0.05和FC>1.5）。论文推测糖苷水解酶和糖基转移酶参与上述糖苷化合物代谢。如，34个葡萄糖苷酶和一个UDP葡萄糖基转移酶可能参与了葡萄糖苷和吡喃葡萄糖苷的代谢。α-葡萄糖醛酸酶、β-葡萄糖醛酸酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶可水解葡萄糖醛酸盐。α-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶、龙胆糖苷酶和鼠李糖苷酶水解半乳吡喃糖苷、半乳糖苷、龙胆糖苷和鼠李糖苷。
参考已有的曲霉基因组报道，本文发现119个蛋白质，注释到35家族或亚家族的酶，能够降解纤维素，淀粉、木质素、果胶、木聚糖和木聚糖等植物多糖。如，内切葡聚糖酶、α/β-葡萄糖苷酶和纤维素酶可能与纤维素的降解有关；α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶降解淀粉；过氧化物酶和裂解酶多糖单加氧酶、葡萄糖-甲醇胆碱氧化还原酶、葡萄糖氧化酶、醇氧化酶和半乳糖氧化酶参与木质素的降解。植物多糖的降解可以溶解茶叶细胞壁，导致使茶叶变软。之前，课题组鉴定了在普洱茶工业发酵过程中的可能参与茶叶代谢的碳水化合物酶。因此，本研究认为，曲霉菌在普洱茶中的作用之一是产生碳水化合物酶，参与糖苷与多糖代谢，产生低聚糖和可溶性糖，与普洱茶甘甜、醇厚滋味有关。
与酚类物质代谢有关的酶
本研究共鉴定到77个多酚类和22个苯类化合物，这些代谢物可归为酚类化合物，包括（±）-儿茶素、没食子酸和槲皮素等。这些化合物可进一步归类为酚苷（38个代谢物）、酚酯（11个没食子酸盐和1个咖啡酸盐）、酚酸（12种代谢物）和其他。与CK相比，在Asn、Ast和Asf中，18、53和48种酚类化合物的相对含量显着降低VIP>1.0，p<0.05，FC<0.66），29个、40个和36个酚类物质含量增加（VIP>1.0，p<0.05和FC>1.5）。如上所述，酚苷被糖苷水解酶降解，如：葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶和鼠李糖苷酶。另外，曲霉菌发酵后，部分黄酮苷类化合物的相对含量增加，可能与被注释到GT1家族中的UDP葡萄糖醛糖基或UDP葡萄糖基转移酶有关。
代谢组鉴定到（-）-儿茶素没食子酸酯、儿茶素3-没食子酸酯等11种没食子酸酯，相对含量下降；鉴定到 2-cinnamoyl-1,6-digalloylbeta-D-glucopyranose相对含量增加。另外，在Asn中，epigallocatechin 3-O-caffeate相对含量增加。鉴定到12个酚酸，其中 3,4-dihydroxy-phenylacetic acid 和 salicylic acid 相对含量增加。手动检查UniProt注释，在Asn、Ast和Asf中发现6个（A0A100IAT1，A0A146F2H6，A0A1L9N5Y7、A0A1M3T559、A0A1R3RGG8和G3YCQ1）、4个（A0A0L1J7V2、A0A1L9N5Y7、A0A1S9DXC9和Q000I5）和3个（A0A1L9N5Y7，A0A1S9DKA2和Q000I5）单宁酶。单宁酶（E.C:3.1.1.20）是一种催化水溶单宁中酯键裂解的酶，如水解单宁酸，产生没食子酸和葡萄糖。单宁酶能水解没食子酸酯并释放酚酸，可以解释这些没食子酸酯类物质的含量降低，以及酚酸类物质含量升高，而没食子酸酯的水解则是导致茶叶涩味降低。
辅助活性酶是氧化还原酶，与碳水化合物活性酶共同作用。本文在Asn、Asf和Ast中鉴定到26、26和34个AA酶，注释到7科、8科和10科中。其中AA1、AA4、AA6分别与漆酶、香草醇氧化酶和苯醌还原酶同源，可能参与多酚的氧化、转化和生物降解，并导致多酚含量下降，茶褐素水平升高。多酚类物质含量减少会降低涩味，增加醇厚的味道，茶褐素的增加使汤色变成红褐，并增强保健功能。
综上，我们提出了曲霉对茶多酚和苯类化合物的代谢途径：（1）酚苷由糖苷水解酶或糖基转移酶水解或合成；（2）酚酯经单宁酶水解，产生酚酸；（3）酚类化合物被漆酶氧化或聚合，酚类化合物中的芳香环被苯醌还原酶降解（图1）。因此，曲霉在普洱茶发酵中的另一个作用是产生糖苷水解酶、糖基转移酶、单宁酶、漆酶、香草醇氧化酶和苯醌还原酶，催化酚类化合物的水解、氧化、转化和生物降解。在之前的报告中，我们描述了普洱茶工业发酵过程中酚类化合物的代谢网络。对纯培养发酵样品进行蛋白质组学分析，不仅证实了糖苷水解酶、糖基转移酶和单宁酶的存在，而且鉴定了漆酶、香草醇氧化酶和苯醌还原酶。Lee et报告说，从普洱茶叶中分离出的曲霉产生的漆酶可将EGCG氧化为游离儿茶素、酯儿茶素、没食子酸和茶色素。在最近的研究中，我们阐明了黑曲霉产单宁酶及其对茶叶中没食子酸酯的水解作用。因此，糖苷水解酶、糖基转移酶、单宁酶和漆酶的存在，以及漆酶的氧化和单宁酶的水解作用得到了证实，其他酶的存在和催化作用有待进一步研究。
图 1. Enzymes involved in metabolism of tea phenolic compounds.
结论：
本文将黑曲霉、溜曲霉和烟曲霉接种到茶叶中，开展单菌发酵。采用蛋白质组学和代谢组学相结合的方法对真菌蛋白和茶叶代谢物的变化进行了表征。鉴定了曲霉产生的与纤维素、淀粉、木质素、果胶、木糖和木聚糖等多糖降解有关的酶。确定了可能催化酚类化合物水解、氧化、聚合、转化、生物合成和降解的酶。本单菌发酵分析表明，曲霉在普洱茶发酵中的作用是：（1）产生碳水化合物活性酶，代谢糖苷和多糖，提升普洱茶的醇和滋味；（2）产生糖苷水解酶、糖基转移酶、单宁酶、漆酶、香草醇氧化酶和苯醌还原酶，水解、氧化、转化和降解茶叶酚类物质，降低茶多酚的含量，提高茶褐色素的含量，进而降低茶汤的涩味、增加了滋味的醇和，以及促使汤色变得红褐。这些发现获得了有关曲霉在普洱熟茶感官品质和保健功能形成中的新知识。
参考文献
/10.1016/j.foodchem..127560
●创新性/应用前景
关联应用蛋白组和代谢组研究发现了，曲霉产生的参与糖、酚类物质代谢的酶，贯穿菌、酶、物质代谢，获得了普洱熟茶品质形成机制的新知识。
专 家 简 介
赵明，教授，博士生导师，云南省万人计划-青年拔尖人才，云南省中青年学术技术带头人（后备人才）；博士毕业于中国科学院成都生物研究所。主持国家重点研发计划课题、国家基金等项目5项，发表论文50多篇，其中以第一作者或通讯作者在“mSystems”、“Food chemistry”“Journal of agricultural and food chemistry”、”Electrophoresis”等期刊发表SCI收录16篇，第一发明人获授权发明专利4项。
攥稿人：张晨
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云南农业大学赵明教授团队：联合应用蛋白组与代谢组学技术研究三种曲霉在普洱熟茶发酵中的作用与机制
