图片引自：/dna-replication-3981005
DNA是生命体最主要的遗传物质。遗传信息精确而完整地从亲代（细胞或个体）传递到子代（细胞或个体）则依赖DNA复制，它是生物体生长发育及繁殖的基础。DNA复制起始所发生的位点被称为DNA复制源（Origin）。大肠杆菌只有一个长度约为240 bp、序列固定、内部结构特征被研究得非常清楚的DNA复制源OriC【1】，它是DNA复制起始相关蛋白结合的地方。在真核细胞中，随着基因组逐渐增大，为保证在较短的时间内完成DNA复制，DNA复制源的数目也逐渐增多。这些DNA复制源并不是随机散在于基因组上的，它们的分布受顺式作用元件和反式作用因子共同调节。不仅如此，不同物种的复制源的结构特征和序列长度差异也很大。在芽殖酵母S. cerevisiae中，大约存在12000个潜在的DNA复制源（即自主复制序列，autonomous replication sequence ，ARS），但每个细胞在一个细胞周期中大约只利用400个作为真正起始DNA合成的地方。ARS长约100 bp并包含11 bp富含AT的保守序列，这是DNA复制源识别复合物ORC的主要结合位点【2,3】。
芽殖酵母S. cerevisiae的自主复制序列【1】
裂殖酵母S.pombe的复制源大小为500~1000 bp，并包含非对称的、富含AT的序列【4–6】。这些表明，在低等真核生物中，复制源也存在明确的顺式作用元件以起始DNA复制。那么，高等真核生物的DNA复制源是否也具有保守的序列特征或顺式作用元件呢？
目前，在非洲爪蟾、果蝇、小鼠和人细胞中的研究很多，但均尚未发现其具有保守的顺式作用元件，更不清楚其序列特征。不仅如此，关于这些物种中的DNA复制源的鉴定还存在较大争议。利用不同原理和方法鉴定的DNA复制源大小和位置差别极大，可重复率极低（~10-30%）【7】。因此，准确鉴定并剖析哺乳动物细胞的DNA复制源，研究DNA复制起始的调控机制一直是该领域的研究难点和热点。
不同方法鉴定的人细胞复制源的可重复率极低【7】
弗罗里达州立大学的David M.Gilbert实验室一直从事DNA复制相关的研究，近年内提出了复制起始时序（replication timing）的概念，从这个角度来研究DNA复制的时空调节机制。即真核生物中，基因组的复制按照程序化的时间顺序进行。一些染色质结构域通常在S期早期起始复制；而另一些结构域倾向在稍晚期起始复制，这些结构域被他们定义为复制结构域（replication domain）【8】。在哺乳动物中，复制结构域通常长400-800 kb，尽管复制结构域较人们期望鉴定出的复制源的尺度大数百倍，然而他们发现复制结构域所在位置呈现出不同细胞类型之间一定的维持性（preserved）和物种间的一定的保守性（conserved）【9,10】。
复制结构域内复制起始时间早晚受细胞分化的调控，至少一半以上的基因组在发育过程中发生了复制起始早晚的转变，这些转变与细胞转录状态、染色质之间的相互作用强弱都有关系——早起始的复制结构域通常与转录活跃区有关【11】, 晚起始复制结构域通常与细胞核边缘——核纤层结构域（lamin-associated domains）高度重合，复制结构域与染色质相互作用结构域（topologically-associatingdomains, TAD）的边界几乎一一对应【12】，这些都暗示着复制作为一个生物学过程与染色体的三维结构调控有着密切的关系。然而，复制的时间调控的分子机制还不甚清楚，是否存在顺式作用元件调控复制起始的时间早晚并不清楚。
弗罗里达州立大学David M. Gilbert等于12月27日在Cell 上发表了题为Identifyingcis Elements for Spatiotemporal Control of Mammalian DNA Replication的研究进一步揭示DNA早期复制受顺式作用元件调控。
研究人员通过在小鼠胚胎干细胞的一个选定TAD内构建的一系列CRISPR-Cas9片段敲除和片段倒置的方法，鉴定出了调控复制时空程序的顺式作用元件（early replication control elements，ERCE），敲除ERCE导致复制起始时间由早向晚转变，也带来转录以及染色质结构方面的改变。他们鉴定出ERCE有以下几种特点（1）能够形成一些不依赖于CTCF-cohesin的长距离染色质间的相互作用，可以驱动A/B compartment 的分化；（2）促进转录活跃，是一些细胞特异的转录因子（P300, Oct4,Sox2,Nanog）结合的位点;（3）ERCE是冗余的，敲除他们中的某一个并不一定对Replication Timing产生较大影响。
该工作是其发表于Nature上的工作的延续，他们之前的研究表明：DNA复制起始的早晚与染色质拓扑结构域（TAD）及其边界（boundary）相关【12】。TAD结构的边界通常由识别特定DNA序列的CTCF及与之相互作用的Cohesin蛋白共同维持。为证实之前的发现，该组首先在mESC细胞中选定了与细胞干性相关、活跃转录、自成一个独立的TAD且在该细胞中是S期早期开始DNA复制的区域——Dppa2/4domain。该区域在分化后的细胞中，其转录将被抑制且在S期较晚的时候开始DNA复制，但TAD结构保持不变。
mESC细胞Dppa2/4domain的特征
他们通过CRISPR-Cas9删除了包含TAD边界的CTCF结合序列发现，该区域的DNA复制起始的时间并未改变。直接通过降解CTCF蛋白也证实了这一发现。而进一步删除TAD内部的序列发现，删除内部345 kb的序列将直接导致该domain由早期复制转变为晚期开始DNA复制。这表明该345 kb区域内存在直接调节DNA早期复制的因素。
删除内部345 Kb的序列将直接导致Dppa2/4 domain由早期复制转变为晚期开始DNA复制
他们推测这可能是因为该区域存在不依赖CTCF和Cohesin的拓扑结构。通过capture-HiC，他们发现Dppa2/4 domain中345 kb区域内有3个位点染色质相互作用较强，即a(3.5 kb)， b (46.3 kb)和c (39.0 kb)，这三个位点的相互作用并不依赖CTCF，其强相互作用可能与这三位位点富集的活跃转录的表观标记和增强子或超级增强子区域特点相关。同时将abc删除可以完全重现删除的345 kb区域的现象；单独敲除a或b并不改变Dppa2/4domain的复制时间，而单独敲除c可以明确抑制c附近区域而影响a和b区域附近的DNA早期复制。这些说明Dppa2/4 domain中存在3个相互冗余的顺式元件以调节该区域的DNA早期复制。他们将这些顺式元件命名为ERCEs（early replication control elements）。
Dppa2/4domain 存在三个ERCEs及ERCEs的特征
进一步分析发现，同时敲除这三个ERCEs将减弱Dppa2/4 domain所在TAD的相互作用强度，而且该区域将有A compartment转变为B compartment。不仅如此，这三个ERCEs的删除将将直接抑制Dppa2/4 domain中所有基因的转录，而受影响的转录并不直接影响DNA复制的早晚。
Dppa2/4domain中的三个ERCEs调控DNA转录
通过将包含ab的680 kb区域或包含a的435 kb区域原位颠倒，他们发现ERCEs存在的位置依然是DNA早期复制的区域，而Dppa2/4domain中未改变区中的DNA复制起始时间在一定程度上变晚。这说明ERCE可调控复制早期起始。
验证Dppa2/4 domain中ERCEs的真实性
进一步将这三个ERCEs的特征推广至mESC细胞的全基因组范围，他们共预测了1835个ERCEs，验证发现，部分敲除ERCEs可以明显的延迟该ERCEs所在区域的早期DNA复制。这表明他们的预测可能是准确的。通过对全基因组的1,835 个预测的ERCE分析，尽管有33.9%的ERCE都与enhancer重合，20.2% 的与super-enhancer重合，预测出的ERCE也与其他的开放染色质标记有所重合。然而并非所有激活的启动子和增强子都是ERCE，转录和复制时空调控可能有着尚待阐明的联系。
在全基因组水平鉴定并验证ERCEs
总体上讲，该研究是DNA复制起始领域的一项重要研究。它证实了，在染色质层面存在顺式作用元件——ERCEs直接调控早期DNA复制。然而，目前仍不清楚该元件调节DNA复制早晚的具体因素，DNA序列？组蛋白修饰？还是相互作用蛋白？亦或是特定生物事件？同时，由于ERCEs调节的生物事件较多，ERCEs是否直接调节DNA复制的早晚，这也有待进一步确证。而且，目前也不清楚晚期复制的区域是否也存在类似的顺式调节元件，也不清楚ERCEs是否在小鼠其它细胞和其它高等真核生物，特别是人细胞中也保守。另外，早期DNA复制区域内必然存在DNA复制源，因此ERCEs也将调控该区域内的DNA复制源的活性，然而DNA复制源是否存在特定顺式作用元件，ERCE与DNA复制源存在怎样的调控关系，仍然有待进一步阐明。
注：北京大学生命科学学院胡家志课题组以淋巴细胞为研究对象，致力于探究DNA复制、DNA损伤修复和染色体重组等过程中淋巴细胞基因组稳定性的维持机制及其与基因转录、三维基因组等的相互关系，以阐明DNA代谢过程诱发原癌性突变的分子基础。实验室网站链接：http://hulab.。
原文链接：/science/article/pii/S0092867418315617
参考文献
1. Leonard, A. C. & Mechali, M. DNA Replication Origins. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5,a010116–a010116 ().
2. Marahrens, Y. & Stillman, B. A yeast chromosomal origin of DNA replication defined by multiple functional elements. Science 255, 817–823 (1992).
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11. Hiratani, I., Takebayashi, S., Lu, J. & Gilbert, D. M. Replication timing and transcriptional control: beyond cause and effect--part II. Curr. Opin.Genet. Dev. 19, 142–149 ().
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