本文作者：窦凯琦 段成宝
编辑排版：张日鹏
在我们的生活中，微生物时时刻刻伴随着我们，它们看不见摸不着，甚至容易让大家忽略它们的存在。末，新冠病毒引起的肺炎疫情爆发，让微生物这个群体重新引起人们的重视。
微生物包括细菌、真菌、病毒以及少数藻类等，微生物群体千姿百态，有益也有弊。在过去几千年里，人们一直与微生物斗智斗勇，甚至一段时间将一些微生物造成的疾病归为天灾神论。作为微生物中重要的成员，真菌种类繁多，是仅次于昆虫的第二大生物类群。真菌与人们的生活息息相关，在自然界中负责有机物质的分解。此外，大型子实体真菌可以食用，有一些还可以入药。
1928年英国科学家弗莱明在点青霉菌中发现了具有抑制金黄色葡萄球菌的活性物质——青霉素，拉开了人们使用抗生素对抗细菌性感染疾病的序幕。目前临床上广泛使用的青霉素、降血脂药物洛伐他汀、以及免疫抑制剂环孢菌素等均来自真菌次级代谢产物或衍生物。进入新世纪以来，真菌中发现的活性天然产物已成为微生物活性化合物的主要来源。
自然界中的真菌（图片来源于网络）
随着越来越多真菌基因组测序的完成，为我们从分子水平上揭示基因的功能提供了条件。然而由于真菌基因组相对较大，细胞结构复杂，大部分真菌缺乏有性阶段，基因操作困难，严重阻碍了真菌遗传学的研究。因此有必要建立和完善真菌的遗传转化系统，为基因功能研究提供便捷的技术手段。
建立真菌的遗传转化系统，首先需要向真菌细胞中导入遗传物质。目前真菌中DNA的导入方式主要包括聚乙二醇（PEG）介导的原生质体转化法、电激转化法、转座子法、基因枪法、限制酶介导法、农杆菌介导法等。
PEG介导的原生质体转化方法首先需要通过酶法获得原生质体，然后在PEG诱导下促进原生质体吸收外源DNA，钙离子增加细胞膜通透性。尽管很多真菌都可以采用这种方法进行转化，但由于不同真菌细胞壁结构的差异，转化效率相差很大，尤其是对于大型真菌（如灵芝）的转化效率很低。
电激转化法是利用高压脉冲作用，在真菌质膜上形成可修复的瞬时通道，使外源DNA进入受体细胞，环状DNA较线性DNA转化效率稍高。
转座子是染色体或质粒上一段可移动的DNA片段，可以从一个位置跳跃到另一个位置。但这种转化方法适用范围很局限，并不是所有真菌中都存在转座子，且其不稳定性和随机性也无法满足详细的基因分析。
基因枪法又称微弹技术。外源DNA包裹在微小的金粒或钨粒上，在高压下高速射入真菌细胞。基因枪法简单，转化时间极短，但受真菌细胞大小影响以及成本造价都限制了该方法的应用。
限制酶介导法是将限制性内切酶及其切割的DNA片段导入真菌细胞，限制性内切酶作用于基因组并产生与DNA片段相同的粘性末端，目标DNA片段整合到基因组上。相对于前面几种转化系统，限制酶介导法只能通过基因插入产生突变。
农杆菌介导法是利用农杆菌Ti质粒上Vir基因家族的表达，将T-DNA及外源DNA一起整合至真菌细胞基因组上。相比于其他转化方法，可用该方法进行遗传转化的真菌种类较多，转化效率相对较高，且转化子稳定。
在人工核酸基因操作领域，最有名的基因编辑方法是 CRISPR/Cas9 技术。CRISPR/Cas是细菌和古细菌在进化过程中形成的一种获得性免疫系统，在对抗外来 DNA 的适应性免疫系统中起着重要的生物学作用，主要是针对噬菌体和病毒侵染的一种防御机制。CRISPR/Cas 系统的出现彻底改变了生物学的研究，目前在诸多领域内发展了许多创新性的应用，在真菌的遗传学研究和工业应用中表现出巨大的潜力。
精准基因编辑（图片来源于网络）
真菌遗传转化系统的建立和完善为特定基因的功能以及代谢及调控研究提供了技术支持，也为真菌菌株的定向遗传改造提供了条件。研究人员可以通过简单插入/删除/敲低等策略来确定一个基因的功能，从而研究与功能以及与其相关的调控或互作机制，并可按照生产实践的需求对工程菌株进行定向改造和优化，使真菌更好地为人所用。
参考资料：
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部分图片来源于网络
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