本文转载自“医麦客”。
在目前无特效药的情况下，康复期血清疗法是治疗重症或者危重症新冠肺炎一个重要方法，实际上就人体对病原微生物免疫应答产生的中和抗体（疫苗也有同样的效果）。在国内开展的康复期血清疗法随机、双盲、对照的临床研究初步结果显示，应用恢复期血浆治疗明显好于对照[1]。美国FDA在4月3日也宣布开发该疗法用于新冠肺炎病人治疗。但是该疗法主要缺点就是来源有限，难于质控，中和抗体滴度低。因此，研发易于生产与质控的单克隆中和抗体可能是潜在的治疗新冠肺炎的“特效药”。这一点在埃博拉病毒疫情的中和抗体开发中已得到充分证实，例如对抗埃博拉病毒的mAb114、REGN-EB3（三种单克隆抗体组合的鸡尾酒疗法）可将将死亡率由67%降低至11%和6%，9月美国FDA授予单抗mAb114突破性药物资格。
科技部也开展了《新型冠状病毒中和抗体的应急项目申报指南》（简称《申报》），对中和抗体规定了下面的标准
·人源化程度高
·亲和力<10nM
·真病毒中和实验IC50<10nM
众多抗体药物研发企业和高校院所都竞相开展了抗体药物的研发，靶点基本都是新冠病毒的S蛋白。从3月中旬第一个新冠病毒中和抗体问世，一个多月时间已经有多个具备真病毒中和活性的中和抗体（只做到假病毒中和活性不计入内）发表。根据《申报》中的参数要求，把这些抗体按下表进行了总结：
*H4的病毒中和活性略强于B38，而SPR的结果B38亲和力是H4的10倍以上，特别是解离常数的差别，但是从BLI的解离常数看，两者差不多。
备注：目前文章3，4，5，6，7，8发布在预印版上。BLI是ForteBio的生物膜干涉技术。
本文将总结这些文章的成果进展和启示，希望可以为未来中和抗体的研发提供更多参考。
与时间赛跑
抗体的筛选往往是从免疫动物开始，但是免疫动物至少1-2个月时间，新冠病毒来势汹汹，往往耗不起这个时间。比较快的方法有：
·从治愈的病人B细胞里提取中和抗体，比如文章3、5、7、8是从SARS康复病人或新冠康复病人中提取。
·从现成的抗体库中进行筛选，比如文章1在3月10日左右发布预印版文章，发现了第一个新冠中和抗体，就是从现成的免疫了SARS，MERS·S蛋白的全人源转基因小鼠的杂交瘤库中进行筛选的。文章2是从人源化单域抗体噬菌体库中筛选出来的。
抗体库筛选，表达纯化到体外鉴定，如果有良好抗体工程技术积累的实验室，只要2-3周就可以完成这些工作，病毒的中和实验需要P3/P4实验室，并且需要有经验的专门操作病毒中和实验人员，所以在最短时间内，需要调取各种资源。比如文章4，免疫血清是在上海的一家公司制备的，而抗体纯化是武汉一家抗体药研发公司，病毒中和实验和生物膜干涉技术测定亲和力是在武汉病毒所完成的，各个单位发挥其技术优势。如果需要做晶体结构解析应该找一个这方面厉害的单位合作。这篇文章虽然需要免疫动物，但在2个月时间内完成了抗体的前期鉴定工作。
识别保守表位才是王道
很多人认为阻断受体结合是中和抗体的First Priority，其实目前的中和抗体只有文章5和7是阻断型抗体，所以考虑到RNA病毒的高频率突变性，筛选结合表位保守性强的中和抗体才是王道。但这件事情并不容易，文章2中，有一个对某株新冠病毒有中和活性的抗体就无法识别另外一株新冠病毒的突变株。而文章5中所有与新冠病毒结合的抗体都不与SARS发生交叉反应。所以国外一些实验室更倾向于用免疫SARS蛋白的抗体库去筛选可以识别更保守表位的新冠病毒抗体。文章3在SARS康复病人体内提取了一个新冠中和抗体S309，并用冷冻电镜解析了抗体和S蛋白复合物的结构，发现S309中和抗体识别的24个氨基酸残基在所有已知的新冠病毒突变株中均未发生突变，其中19个与SARS一样。因此，S309有可能成为一种冠状病毒广谱的中和抗体。
S309与SB的复合物结构解析，S309的结合位点远离ACE2的结合位点
还有一个可以识别保守表位的抗体是CR3022，也是目前研究的最透彻的抗体，多个实验室已经解析了CR3022与S蛋白的结构，这个抗体不仅可以识别SARS-COV和新冠病毒的S蛋白，还可以识别类似于新冠病毒的蝙蝠来源的冠状病毒的S蛋白，可以说是非常厉害的存在。虽然中和能力弱了一些，但是可以通过改造提高CR3022的亲和力和中和效力。
目前来说，收集足够多的病毒突变体，并对其一一进行中和活性检测还比较困难，所以比较好的方法是对抗体/S蛋白复合物进行结构解析，鉴定相互作用位点，并从数据库分析上判断这些位点的保守性。比如文献3，6，7。
ADE有没有？
ADE（抗体依赖增强作用）是指体内病毒抗体反而会增加病情，在登革热和SARS都有观察到，会给疫苗研究带来很大挑战。从SARS的疫苗研究来看，主要是结合病毒的抗体会和巨噬细胞上的Fc受体结合，介导病毒侵染巨噬细胞，并将其转变成促进炎症的巨噬细胞，从而大量释放炎症因子，形成“细胞因子风暴”，损伤肺部组织[3]。普遍认为，中和抗体因为浓度高，特异性强，ADE效应的风险较低。
文献4将抗体的Fc段切除，抗体就不会与Fc受体结合，降低了导致ADE效应可能性。但是文献3发现Fc段与Fc受体的结合同时也可以介导免疫细胞对感染病毒细胞的清除（ADCC效应）。所以有没有ADE必须通过动物保护实验来获知。再生元的埃博拉中和抗体mAb114就是可以介导ADCC的IgG1抗体（具体可以参考《一个埃博拉神药的故事》）。
中和抗体亲和力与病毒中和活性息息相关
中和抗体要起到中和作用，肯定需要与靶点有比较强的结合能力，特别是解离要慢，这样可以保证大部分的病毒都被抗体牢固的结合。文章4中，比较了抗血清用proA亲和柱纯化的抗体和用SRBD亲和柱再进一步纯化的抗体的亲和力和中和病毒IC50的关系。用ForteBio的链霉亲和素传感器固化S蛋白RBD结构域，与S·RBD亲和柱纯化前后的抗体的亲和力。
S·RBD亲和柱纯化前的抗体真病毒中和活性和亲和力
S·RBD亲和柱纯化后的抗体真病毒中和活性和亲和力
可见，后者的ForteBio检测的亲和力提高了2个数量级，而中和活性也提高了2个数量级。
其他文章也发现了亲和力和新冠病毒中和活性之间的关系[4-5]。
未来的方向——鸡尾酒疗法
考虑到病毒的高突变性，即使是能识别保守表位的抗体也无法识别所有突变病毒。所以需要特对抗体进行表位分组，将具有中和活性的识别不同表位的几个抗体混合（鸡尾酒疗法）往往会有协同作用。一种埃博拉中和抗体“神药“是再生元公司的鸡尾酒疗法REGN-EB3，由三种单克隆抗体组成 [6]。
文章3首先进行了表位分组，将筛选的一些中和抗体分成两组：
通过表位分组（用ForteBio的HIS1K传感器固化S RBD蛋白，依次结合两个抗体，列为第一个抗体，行为第二个抗体），发现S309,S303是一组，S304，S315是一组，而后一组的病毒中和活性比较弱
将S309和S315混合，病毒中和活性比S309和S315任意一个都高，S309和S304的组合也看到同样的结果。文章2也发现了类似的鸡尾酒疗法协同效应。
病毒中和实验表明S309和S315有协同作用
展望
按照《申报》的要求，只有文章1、3、5、8中的抗体能够符合要求。其他的抗体要么亲和力大于10nM，要么IC50大于10nM，要么人源化程度低。
新冠病毒中和抗体研究的下一步：
需要建立合适的新冠病毒的动物模型进行动物保护实验，并考察抗体依赖的病毒感染增强效应（ADE）。 目前，只有文章7在ACE2转基因小鼠上进行了保护实验。
体外实验中也要进行更多突变株的病毒中和实验以确认抗体识别的保守性。 如果有条件，还需要对中和抗体做结构学的研究，确认结合位点的保守性，也可以为疫苗研制提供理论基础。
在识别保守表位的基础上，可以对中和抗体的进行亲和力成熟，以提升抗体的中和活性。
表位选择，是否一定是在RBD区域？ 可能还要其他选择，比如文章8提到的NTD表位的4A8中和抗体。
多种保守表位组合，进行鸡尾酒疗法开发。
虽然中和抗体和其他药物一样必须经过临床Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期实验，还有很长的路要走，但是在诸如埃博拉病毒中已经获得了很大的成功，所以中和抗体很有可能成为新冠肺炎治疗的一种突破性疗法。相信后面随着新冠病毒的基础研究方面越来越完善，会有更多中和活性更高，保守性更好的抗体出来，让我们拭目以待！
