喜报：易基因针对检测原核菌个性化设计rRNA去除探针的原核转录组研究成果见刊《CHEMOSPHERE》
5月2日，中南大学与易基因合作的微藻对镉胁迫响应机制研究成果以“Longitudinal Physiological and Transcriptomic Analyses Reveal the Short Term and Long Term Response of Synechocystis Sp. Pcc6803 to Cadmium Stress”为题在中科院环境二区TOP期刊《CHEMOSPHERE》（IF 7.086）上在线发表。该研究通过纵向生理学和转录组学分析揭示了微藻对镉胁迫的短期和长期响应分子机制。
标题：纵向生理学和转录组学分析揭示了集胞藻PCC6803对镉胁迫的短期和长期响应
时间：-05-02
期刊：CHEMOSPHERE
影响因子：IF 7.086
技术平台：原核转录组测序分析、WGCNA分析
摘要：
由于镉(Cd)的生物蓄积性和生物不可降解性，即使在低浓度下，镉也会对生态系统构成严重威胁。微藻是一种很有前途的重金属去除剂和有效的工业污水净化剂。然而，关于镉胁迫下微藻的短期和长期响应分子机制的详细报道很少。本研究对微藻在EC50值（concentration for 50% of maximal effect,EC50）下的吸附行为（生长曲线、Cd去除率、SEM、FTIR和胞外多糖(EPS)动态变化）、细胞毒性（光合色素、MDA、GSH、H2O2、O2-）和胁迫响应机制进行探讨。通过原核生物的转录组RNA-seq在对照和15 min、48 h、72 h和96 h处理组中检测到1413个差异表达基因（DEGs）。这些基因被证明是镉敏感DEGs，且与核糖体、氮代谢、硫转运蛋白和光合作用相关。WGCNA（加权基因共表达网络分析）揭示了两种主要的基因表达模式：短期响应（381个基因）和长期响应（364个基因）。DEGs富集分析表明，参与氮（N）代谢、硫转运蛋白和氨酰-tRNA生物合成的基因表达显著上调，为初期合成金属螯合蛋白、抗性金属蛋白和转运蛋白（ABC转运蛋白）的重要组分（半胱氨酸）提供了原料，是一种短期响应机制。前15分钟的Cd吸附主要依赖于膜转运蛋白和预先蓄积的EPS。同时，上调的谷胱甘肽S-转移酶（GSTs）家族蛋白在外源性镉的初始抗性中发挥作用。受损的光合系统在后期得到修复，糖酵解和糖异生表达上调，满足生理代谢活动的能量和物质。本研究首次提供了微藻响应镉胁迫的短期和长期分子机制。同时，本研究中鉴定的关键基因可以作为藻类基因工程的潜在靶点。
关键词：
镉胁迫，集胞藻PCC6803，原核转录组RNA-Seq，WGCNA（加权基因共表达网络分析）
背景：
由于工业化、城市化和技术发展，重金属污染是全球最严重的环境污染问题之一。镉（Cd）作为一种主要重金属污染物，即使在低浓度下也毒性高、流动性强且难以降解，不仅对水生生物和土壤环境构成威胁，而且通过食物链的蓄积对人类健康有害。
蓝藻是光自养微生物，对重金属具有很强的富集能力和对污染物的敏感响应，被广泛用作生物修复材料，用于处理重金属污染物和评估水生系统中重金属的风险。蓝藻最显著的优势之一是能够产生EPS，EPS可以用作重金属吸附。然而，关于EPS在重金属吸附中的作用以及相关的分子机制，目前仍知之甚少。
微藻已发展出一系列防御机制来响应重金属胁迫引起的氧化损伤，如金属排泄、金属螯合物合成和抗氧化系统激活，金属硫蛋白（MTs）和植物螯合蛋白（PCs）通过螯合游离金属形成镉络合物在镉解毒中发挥重要作用。微生物对镉胁迫响应是镉多种调节机制的结果。尽管此前有研究对集胞藻PCC6803进行全基因组测序，然而，集胞藻PCC6803对镉胁迫响应机制的纵向时间轴变化尚不清楚。本研究通过EC50值下的微藻生长状态、镉吸附率、EPS含量、叶绿素含量、抗氧化剂（谷胱甘肽）和ROS水平的动态变化，结合RNA-seq分析，鉴定出微藻对镉耐受和防御的关键基因和响应途径。这些结果有助于进一步阐明集胞藻PCC6803对镉胁迫短期和长期响应分子机制，为培养抗重金属胁迫的蓝藻工程提供理论依据。
方法：
微藻（集胞藻PCC6803）在含有BG-11培养基的锥形瓶中生长，并在光培养箱中静态培养。将CdCl2.2½H2O加入无菌水中制备1.0 g/L的 Cd2+溶液。Cd2+溶液通过0.2μm孔滤器过滤消毒。将Cd2+溶液添加到含有100 mL培养基的锥形瓶中，使终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/L，将不含Cd2+的培养基用作对照。用血细胞仪计算不同镉浓度下的细胞数。所有实验均设置三个生物学重复。为确保胁迫效应和生长状态，选择EC50值实验。
RNA文库制备测序分析
用0.5 mg/L Cd（EC50值）处理的微藻样品在0、15 min、48 h、72 h和96 h不同阶段收集在50 mL Falcon管中，并在4°C下以8000 rpm的转速离心5分钟。分离沉淀物并在无菌水中洗涤两次后立即在液氮中冷冻，并在-80°C下储存，直到提取RNA，所有实验均设置三个生物学重复。
易基因提供的原核转录组测序分析，是针对检测原核菌个性化设计rRNA去除探针，利用高通量技术对原核细胞所产生的所有mRNA和sRNA（非编码RNA）进行测序。系统全面解析特定细胞所产生的mRNA和sRNA对生物性状的影响。
结果：
（1）集胞藻PCC6803的吸附行为
图1：在对数生长期添加不同Cd浓度后微藻生长曲线（A），添加半致死浓度后96小时内微藻的生长曲线（B）,Cd去除率（C），每个细胞的平均Cd去除率（D）
图2：培养期Cd胁迫下集胞藻PCC6803的胞外多糖（A）和胞外蛋白（B）动态变化
图3：Cd暴露不同时间集胞藻PCC6803扫描电镜分析
（2）RNA-seq测序分析
为研究集胞藻PCC6803对Cd胁迫的分子机制，作者通过高通量RNA-seq进行比较转录组分析。从微藻的三个生物重复中构建了包含五个处理组的15个cDNA文库进行测序分析。
图4：主成分分析（A），差异基因表达的聚类热图（B），不同时间点（0h，15min，48h，72h，和96h）Cd胁迫的差异基因表达WGCNA分析，微藻共表达模块的聚类树（C）。特征表达趋势（D）（E）
图5：Cd胁迫下微藻基因表达谱变化
图6：光合作用DEGs基因表达模式热图
（3）微藻对Cd胁迫的短期和长期响应分子机制
图7：Cd胁迫下微藻的短期（A）和长期（B）响应机制
结论：
本研究通过对微藻在镉胁迫下的生长、EPS、光合色素、氧化应激和转录组学进行表征，揭示了微藻的短期和长期响应分子机制。前15分钟的Cd吸附主要依赖于膜转运蛋白和预先蓄积的EPS。转运蛋白（ABC）和氨酰tRNA生物合成的表达上调，而光合系统的表达显著下调，表明转运蛋白系统是主要的短期反应机制。同时，光合系统在早期受到Cd胁迫的破坏，随着时间的推移，光化学途径中的基因富集结果表明，光合作用的物质和能量基础可能是导致EPS产生的关键限制因素。
关于原核转录组测序
原核转录组测序可以从基因表达量、基因结构和sRNA调控功能三维度揭示不同生物性状的分子调控机制。如通过计算各组间的差异基因并对差异基因进行富集分析，获得对生物性状影响较大的通路信息；通过预测基因的反义转录本，丰富基因组注释内容；研究sRNA对mRNA的相互作用，从分子调控角度解释生物性状之间的差异。
易基因针对检测原核菌个性化设计rRNA去除探针，利用高通量技术对原核细胞所产生的所有mRNA和sRNA（非编码RNA）进行测序。系统全面解析特定细胞所产生的mRNA和sRNA对生物性状的影响。
技术优势：
针对原核生物设计去除rRNA专属探针，rRNA去除效果好（去除率可达93%）。
同时分析sRNA与mRNA的互作关系，更加全面解读表达互作网络。
研究方向：
原核转录组测序是专业针对原核微生物设计开展的转录组学研究。
基因表达量分析
差异基因鉴定
非编码RNA鉴定等
技术路线：
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参考文献：Redirecting
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