本发明属于医学分子生物学领域，涉及医学分子诊断及生物技术，具体涉及一种用于检测ttn基因突变的引物组合物，以及将该引物组合应用到辅助临床上扩张型心肌病（dcm）的诊断、预防及治疗中。
背景技术：
遗传性心肌病为一种常见的遗传性心脏疾病，其最大的特点为临床遗传异质性。从心室的形态可分为肥厚型心肌病（hcm）、扩张型心肌病（dcm）、致心律失常型右心室心肌病和限制性心肌病。扩张型心肌病和肥厚型心肌病较为常见，是遗传性心肌病的最主要病种。扩张型心肌病是一种原因未明的原发性心肌疾病，本病的特征为左或右心室或双侧心室扩大，并伴有心室收缩功能减退，伴或不伴充血性心力衰竭，室性或房性心律失常多见。病情呈进行性加重，死亡可发生于疾病的任何阶段。扩张型心肌病是心衰的主要原因之一，仅次于高血压和冠心病。众多证据表明扩张型心肌病的发病率高达1/2500，已经成为一种全球性的疾病，但部分患者未表现出临床征兆，故dcm的发病率可能高于1/2500。dcm的分子遗传学基础为基因突变，已经报道超过50个致病基因的相关位点突变与扩张型心肌病的发病相关。
目前基因突变的检测方法较多，如：经典而原始的限制性片段长多多态性、核酸分子杂交、taqman-mgb法、snpshot多重pcr技术、毛细管电泳法和高通量测序技术等。以上方法各有优缺点，其中值得一提的是taqman-mgb荧光定量pcr的检测方法，该方法与传统的taqman不同的是在探针的3’端连接了非荧光的猝灭基团mgb(minorgroovebinder，mgb)，当探针序列与模板结合时，mgb能高度结合于dna双链的小沟，增加了寡核苷酸探针和单链模板结合的稳定性，由此通过缩短探针序列长度，增加探针序列的特异性，实现了能区分一个碱基的差别。当具有5’-3’外切酶活性的dna聚合酶对碱基进行延伸时，可把发光基团解离下来，解除了非荧光的猝灭基团对发光基团的抑制，实现了荧光信号的积累与pcr产物的同步进行，从而能较好的区分野生型、纯合突变和杂合突变样本。
taqman-mgb对单核苷酸多态性检测方面有较多的应用，如：慢性骨髓增殖性疾病、病原微生物的耐药突变检测和肿瘤细胞p53基因突变等。但目前taqman-mgb探针法还未用于dcm的检测。
技术实现要素：
针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测ttn基因突变的引物组，其包括用于检测ttn基因中c.10840g>t突变的荧光pcr引物组和taqman-mgb探针组；本发明是应用全外显子测序技术，获得扩张型心肌病致病基因新突变，并通过荧光定量pcr技术，对ttn-c.10840g>t新突变进行简便、快速和准确的检测。
所述用于检测ttn基因中c.10840g>t突变的引物组为如seqidno:1和seqidno:2所示核苷酸序列。
所述探针组为如seqidno:3和seqidno:4所示核苷酸序列。
本发明另一目的是将上述引物组合应用在制备检测扩张型心肌病ttn基因突变的检测试剂中，所述检测试剂包括阳性质控品，所述阳性质控品包括野生型、纯合突变型、杂合突变型阳性质控品；试剂还包括检测用的常规组分：pcr酶预混液、pcr扩增反应混合酶、rox校正染料、ddh2o等。
本发明另一目的是将上述引物组合应用于制备用于检测扩张型心肌病ttn基因突变的检测试剂盒中，所述试剂盒还包括检测用的常规组分：pcr酶预混液、pcr扩增反应混合酶、rox校正染料、ddh2o等，以及阳性质控品，所述阳性质控品包括野生型、纯合突变型、杂合突变型阳性质控品。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
1、应用全外显子测序技术对在临床确诊的扩张型心肌病先证者进行人类基因组全外显子突变筛查，寻找可能的与遗传性dcm发病相关的致病性变异位点；
（1）基因组提取：对入选临床确诊的扩张型心肌病先证者，抽取其外周静脉血，edta抗凝后，采用商业化的miniprepkit(axygen，美国)提取其全基因组后，进行琼脂糖凝胶电泳后、对浓度和od值进行测定，od260/280为1.8-2.0之间为可用；
（2）用酶切法或物理法进行基因组打断，回收目的dna片段；
（3）进行目的dna片段的末端修复和尾端加a(腺嘌呤脱氧核苷酸)；
（4）将上步腺嘌呤化的dna片段加测序接头；
（5）进行片段选择来有效回收两端成功加上测序接头的dna片段，即为捕获前的文库，并通过pcr扩增来进行文库富集；
（6）用外显子探针进行基因组外显子区域的杂交捕获；
（7）捕获后的文库pcr扩增富集；
（8）进行文库质检、稀释和文库间的混合后进行illuminape150上机测序；
（9）以人的hg19基因组为参考基因组，对测序结果进行质量评估和比对分析，比对分析后将发现的变异位点通过如图1所示方法进行测序数据的过滤，经sanger测序验证后，最终确定一个可能与扩张型心肌病发病相关的新变异位点ttn-c.10840g>t；同时对患者家属的该位点进行一代测序的分析，发现该位点在本家族中确实存在家族遗传现象；
2、为建立简便、快速、准确的检测ttn基因中c.10840g>t突变的方法，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种引物及探针序列，所述序列为能检测新突变位点ttn-c.10840g>t的实时荧光pcr引物和taqman-ngb探针序列，核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示、如seqidno:3和seqidno:4所示；
所述taqman-ngb探针序列的5"端标记有发光的报告荧光基团（fam、hex或cy5），3"标记有不发光的淬灭基团；
第二方面，本发明提供一种试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括如第一方面所述的实时荧光pcr引物和taqman-mgb探针序列；
第三方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物及探针或如第二方面所述的试剂盒
用于扩张型心肌病相关致病ttn基因新突变c.10840g>t的检测；
本发明扩张型心肌病相关致病ttn基因新突变c.10840g>t的检测方法如下：
1）提取正常人、携带ttn-c.10840g>t纯合突变型以及携带ttn-c.10840g>t杂合突变型的扩张型心肌病人的基因组；
所述基因组来自于人的外周血、心肌组织、淋巴器官、脾脏、骨髓或肝脏；
2）以步骤1）的基因组为模板，进行pcr扩增，构建野生型、纯合突变型及杂合突变型阳性质控品；
扩增引物如下:
seqidno:5:5"-ttgattatacagtgcaagccctagatag-3"
seqidno:6:5"-caatttgtgaaagggatgcagtatgg-3"；
pcr扩增的反应条件为：95℃预变性3分钟；95℃变性30秒，57℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共40个循环；72℃延伸5分钟；
构建阳性质控品的具体步骤如下：将pcr扩增产物进行纯化，将纯化后的片段克隆到pmd-18t载体上，转化到大肠杆菌jm109，挑选单克隆，测序验证野生型及纯合突变型阳性质粒，将野生型和纯合突变型阳性质粒按摩尔比1:1混合后即得到杂合突变型阳性质控品。
3）将步骤2）得到的阳性质控品采用如第一方面所述的引物进行实时荧光pcr检测；
所述实时荧光pcr的反应体系为：pcr扩增反应混合酶5µl、50×的rox校正染料0.1µl、上下游引物seqidno:1和seqidno:2各0.3µl、taqman-mgb探针seqidno:30.5µl、taqman-mgb探针seqidno:40.5µl、基因组0.5µl、ddh2o为2.8µl；
pcr反应条件为：循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、56℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min。
4）提取待测样品基因组，然后用seqidno:1和seqidno:2引物、taqman-mgb探针组进行pcr实时荧光pcr检测，然后与步骤3）中的阳性质控品扩增结果进行比对，确定检测样品的突变类型，进而诊断患者是否为携带该突变的扩张型心肌病。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
a）本发明一次可检测多个病例样本，具有简便、快速、准确和经济等特点，为扩张型心肌病的临床早期分子诊断和预防建立了新的方法；
b）本发明方法可用于产前诊断，指导优生优育，辅助明确诊断，进行临床干预，家族筛查，进行家族疾病发生风险评估及管理；
c）本发明方法方便快捷，成本低，利用96孔pcr反应管一次性检测多个样本。
附图说明
图1为全外显子测序结果数据过滤分析流程；
图2为本专利中所涉及家族家谱图；
图3为该家族sanger测序结果；
图4为本发明阳性质控品ttn，c.10840g>t菌液pcr琼脂糖凝胶电泳图；
图5为本发明阳性质控品ttn，c.10840g毛细管电泳检测；
图6为本发明阳性质控品ttn，c.10840t毛细管电泳检测；
图7为ttn，10840gg基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的扩增曲线；
图8为ttn，10840tt基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的标准曲线；
图9为ttn，10840gg基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的扩增曲线；
图10为ttn，10840tt基因型的taqman-mgb的灵敏性检验的标准曲线；
图11为以野生型为模板的新变异位点ttn，c.10840g>t的taqman-mgb特异性检测的扩增曲线，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针；
图12为以纯合突变型为模板的新变异位点ttn，c.10840g>t的taqman-mgb特异性检测的扩增曲线，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针；
图13为以杂合突变型为模板的新变异位点ttn，c.10840g>t的taqman-mgb特异性检测的扩增曲线，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针；
图14为以不同基因型为模板的新变异位点ttn，c.10840g>t的taqman-mgb特异性检测的扩增曲线，其中，fam代表野生型探针，hex代表突变型探针；
图15为对15例已知基因型的扩张型心肌病患者进行ttn，c.10840g>t突变位点实时荧光检测的基因分型散点图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。
实施例1：应用全外显子测序技术对在云南省第一人民医院心血管内科临床确诊的12张型心肌病先证者（除收集dcm患者的人口统计学资料外，还收集了其心电图及超声心动图）进行人类基因组全外显子突变筛查，寻找可能的与遗传性dcm发病相关的致病性变异位点。
a、基因组提取：对入选临床确诊的扩张型心肌病先证者，抽取其外周静脉血1ml，edta抗凝后，采用商业化的miniprepkit(axygen,美国)提取其全基因组后，进行琼脂糖凝胶电泳后、对浓度和od值进行测定，od260/280为1.8-2.0之间为可用。
b、用酶切法或物理法进行基因组打断，回收目的dna片段；
c、进行目的dna片段的末端修复和尾端加a(腺嘌呤脱氧核苷酸)；
d、将上步腺嘌呤化的dna片段加测序接头；
e、进行片段选择来有效回收两端成功加上测序接头的dna片段，即为捕获前的文库，并通过pcr扩增来进行文库富集；
f、用外显子探针进行基因组外显子区域的杂交捕获；
g、捕获后的文库pcr扩增富集；
h、进行文库质检、稀释和文库间的混合后进行illuminape150上机测序；
i、以人的hg19基因组为参考基因组，对测序结果进行质量评估和比对分析，比对分析后将发现的变异位点通过如图1所示方法进行测序数据的过滤，经sanger测序验证后，最终确定一个可能与扩张型心肌病发病相关的新变异位点ttn-c.10840g>t；同时对该患者家属的该位点进行一代测序的分析（图2和图3），发现该位点在本家族中确实存在家族遗传现象。
实施例2：检测ttn基因中c.10840g>t突变的荧光定量pcr方法
（1）以实施例1步骤a的基因组为模板，进行pcr扩增，构建野生型、纯合突变及杂合突变阳性质控品；
其中，pcr扩增的引物的核酸序列如下所示，扩增长度为256bp：
seqidno:5ttgattatacagtgcaagccctagatagseqidno:6caatttgtgaaagggatgcagtatgg
反应体系为：模板dna1µl、引物(3.2pmol/ul)1µl、pcr酶预混液10µl、ddh2o7µl。
pcr扩增的反应条件如下：
pcr扩增反应完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图4所示，显示目的片段大小与预期大小一致并对其进行纯化；pcr产物经琼脂糖凝胶dna纯化试剂盒纯化后，用pmd-18t载体进行t-a克隆后，筛选出阳性克隆菌株，提取其质粒载体；后利用abi3130仪器对含有克隆目的片段后的质粒载体进行pcr扩增。
以靶基因ttn（genbank：）的基因序列为模板，利用bioedit序列分析软件对突变进行分析。
结果如图5和6的测序结果可以看出，成功构建野生型和突变型的阳性质控品，将野生型和纯合突变型阳性质粒按摩尔比1:1混合后即得到杂合突变型阳性质控品。
（2）将步骤（1）得到的阳性质控品，采用下述的引物组合物进行实时荧光pcr检测，验证引物-探针的序列的灵敏性；
所述引物及探针序列如下：
反应体系如下：
分别把ttn基因c.10840g>t野生型和突变型模板进行10倍梯度稀释，利用abi7500实时荧光pcr仪对引物探针的灵敏性进行检验，具体条件为：循环外95℃预变性30s，循环内95℃变性5s、56℃退火及延伸34s、45个循环，循环外60℃延伸1min。
结果如图7-10的扩增曲线和标准曲线所示，随着模板起始拷贝数的降低，ct值开始相应增加，标准曲线的线性关系较好（r2>0.98），以上结果说明了引物探针具有较好的灵敏性；
（3）对步骤（2）所述的引物-探针序列的重复性验证
以野生型和纯合突变型模板对该变异位点ttn-c.10840g>t的野生型和突变型的探针分别进行3次重复试验(批内和批间重复)，反应体系及反应条件参照上述步骤（2），观察模板的ct值，并计算其变异系数，变异系数(p)=标准偏差(sd)/平均数(x)，测试检测方法的灵敏性和重复性，结果如表1-2所示：
表1
从表1-2可见，批内和批间重复变异系数均小于2%，具有较好的批内和批间重复性。
（4）对步骤（2）所述的引物-探针序列的特异性验证
特异性验证分别以变异位点ttn，c.10840g>t的野生型、纯合突变型和杂合突变型的阳性质粒为模板，同时加入双标记探针，按照上述步骤（2）中的反应体系及条件，对其进行taqman-mgb的特异性实验验证，结果如图11-14所示。
结果显示：图11中的野生型样本反应的曲线表现为野生型探针产生的荧光信号增高，而纯合突变无荧光信号或仅有很低的荧光信号；图12中的纯合突变表现为只有突变型探针产生荧光信号；图13中的杂合突变样本能使野生型和突变型探针都表现出相对较高的荧光信号；更重要的是，图14所示，通过反应结果的散点图可以明显看出不同基因型的样本单独成簇。
实施例3：采用本发明引物组对已知（sanger测序）基因型的15例扩张型心肌病患者进行ttn，c.10840g>t突变位点进行突变检测
本实施例使用的15例扩张型心肌病患者的基因型是经过使用seqidno:5和seqidno:6引物组，参照实施例2中的反应体系及条件进行pcr扩增，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定有目的大小的片段后，经sanger测序确定的。
以上述15例患者的全血样本的基因组为模板，采用本发明引物组进行实时荧光定量pcr检测，pcr扩增条件和体系见实施例2步骤（2），结果见图15；图15为检测变异位点的基因分型散点图，gg基因型为10例，gt基因型为3例，tt基因型为2例，检测结果与sanger测序结果一致，准确率为100%。
综上所述，由实施例的结果分析可得出，本发明建立了扩张型心肌病致病基因ttn新突变位点c.10840g>t的简便、快速、准确和经济的遗传筛查方法。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110>昆明理工大学
<120>用于检测ttn基因突变的引物组合及其应用
<160>6
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>21
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>1
cccatgtgattgaatactctg21
<210>2
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<213>人工序列(artificial)
<400>2
tagtctccaccacctctgc19
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<213>人工序列(artificial)
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<400>5
ttgattatacagtgcaagccctagatag28
<210>6
<211>26
<212>dna
<213>人工序列(artificial)
<400>6
caatttgtgaaagggatgcagtatgg26
技术特征：
1.一种用于检测ttn基因突变的引物组合，其特征在于：包括用于检测ttn基因中c.10840g>t突变的引物组、探针组。
2.根据权利要求1所述的用于检测ttn基因突变的引物组合，其特征在于：用于检测ttn基因中c.10840g>t突变的引物组的核苷酸序列如seqidno:1和seqidno:2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测ttn基因突变的引物组合，其特征在于：探针组的核苷酸序列如seqidno:3和seqidno:4所示。
4.权利要求1-3中任一项所述的用于检测ttn基因突变的引物组合在制备检测扩张型心肌病的检测试剂中的应用，其特征在于：还包括阳性质控品。
5.权利要求1-3中任一项所述的用于检测ttn基因突变的引物组合在制备检测扩张型心肌病的检测试剂盒中的应用，其特征在于：还包括阳性质控品。
技术总结
本发明公开了一种用于检测TTN基因突变的引物组合，其特征在于：包括用于检测TTN基因中c.10840G>T突变的引物组、探针组；本发明是应用全外显子测序技术，获得扩张型心肌病致病基因新突变，并通过荧光定量PCR技术，对TTN‑c.10840G>T新突变进行简便、快速和准确的检测；本发明一次可检测多个病例样本，为扩张型心肌病的临床早期分子诊断和预防建立了新的方法。
技术研发人员：冯悦;刘莹;夏雪山;贾圆圆;刘丽;赵跃
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：.12.11
技术公布日：.02.28
