作者：古麻今醉
DNA是相对稳定的有机分子，会受到来自各种内源性和外源性损伤的不断攻击。因此，细胞进化出了一个复杂的生化系统来应对这些威胁，统称为“DNA损伤反应”(DDR)，以防止有害突变传递下去。DDR协调DNA修复与细胞周期检查点激活。编码DDR的基因在癌症中经常发生突变，导致基因组不稳定，是许多癌症的内在特征，也是其生长、转移和对DNA损伤治疗 (如放疗) 反应能力的基础。Florian在《nature reviews cancer》上发表了题为《Targeting DNA damage response pathways in cancer》的综述，描述了主要的DNA损伤检查点和修复途径，讨论了使用目前正在临床评估的小分子抑制剂使DDR失活的策略。此外，作者还探讨了DDR抑制剂的耐药机制，以及如何通过理解靶向耐药性肿瘤背后的分子途径来克服这些机制。
DNA损伤激活了由检查点激酶介导的信号级联反应
DDR从损伤识别开始，参与DNA修复途径，根据遗传毒性应激的类型和复杂性，启动细胞信号级联，改变周围的染色质，激活细胞周期检查点并通过改变转录或翻译来修改基因表达。如果损伤不能快速修复，持续的DDR信号传导也可以通过促进分化，衰老或程序性细胞死亡来改变细胞命运。因此，DDR可以保持基因组稳定性，保证遗传物质完好无损地传递给下一代。
ATM和ATR是两种激酶，负责协调细胞对DNA双链断裂（DSB）和复制应激的反应（图1），包括DNA修复，检查点激活，凋亡，衰老以及染色质结构的改变，转录和前mRNA剪接。下游细胞周期检查点激酶CHK1和CHK2分别是ATR和ATM的主要底物，负责下调细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）的活性，阻止细胞周期进展。ATM和CHK2在G1期细胞中对p53的磷酸化导致编码CDK抑制剂p21的转录（图1）。ATM在DSB中招募组蛋白H2AX并使其磷酸化，进而招募DNA损伤检查点蛋白1（MDC1）。在间期细胞中，ATM的MDC1募集和磷酸化，会催化进一步的磷酸化和泛素化事件，导致DNA损伤介质蛋白53BP1和BRCA1的募集。但在有丝分裂期间，53BP1和BRCA1均未募集。相反，酪蛋白激酶2（CK2）依赖性MDC1磷酸化介导MDC1和DNA拓扑异构酶2结合蛋白1（TOPBP1）的相互作用，与PP2A细胞抑制剂（CIP2A）一起被募集到DSB 中（图1）。TOPBP1和CIP2A一起形成丝状结构，可以桥接两个MDC1病灶，从而将两个DSB末端连接在一起。这确保了正确的染色体分离，直到DSB在接下来的G1阶段得到修复。
在细胞周期的S期和G2期，ATR及其下游靶点CHK1主要通过DC25磷酸酶家族的磷酸化和失活介导检查点激活。ATR控制S-G2检查点，在复制完成前阻止进入有丝分裂。ATM则是通过将MRE11-RAD50-NBS1（MRN）复合物与DSB结合而激活的，ATR被ATR相互作用蛋白(ATRIP)招募，随后被复制应激反应蛋白ETAA1或TOPBP1激活，分别在单链DNA（ssDNA）上的RPA结合或在ssDNA-双链DNA连接上的RAD9-RAD1-HUS1复合物结合。因此，ATR在S期被激活。
图1.双链断裂后的细胞周期依赖性DNA损伤反应
多种DNA修复途径处理不同的DNA损伤
最常见的DNA损伤类型是双螺旋中的单链病变，如单链断裂（SSB）或是DNA碱基的化学修饰。大多数此类病变可以通过碱基切除或核苷酸切除而得到修复，或通过跨病变合成在复制过程中完全绕过。在DNA复制过程中，可以掺入错误的核苷酸，导致两个不匹配的碱基，这些由错配修复（MMR）途径处理。此外，脱氧核糖核苷酸还可以被核糖核苷酸取代，掺入基因组，进而核糖核酸酶H2（RNase H2）切除。有时，双螺旋的两条链会发生交联，根据其化学性质，这种DNA链间的交联可以通过Fanconi anaemia（FA）通路，DNA糖基化酶NEIL3或其它不完全表征的链间交联修复途径进行修复。蛋白质也会与DNA共价结合，需要由SPRTN等特殊蛋白酶介导的DNA-蛋白质交联修复。
SSB主要由酶PARP1或PARP2识别，其催化自身和相邻靶蛋白上聚链的形成。PARP1及其在SSB中的聚阳离子活性可以招募支架蛋白XRCC1，该蛋白带来DNA连接酶3（LIG3）和辅助修复因子以重新连接断裂。磷酸化是一个高度动态且通常是瞬态的过程，因为PAR链可以被聚ADP-核糖水解酶（PARG）迅速降解。PARG活性不是简单地作为SSB修复的负调节因子，而是将PARP和磷酸化蛋白恢复到去ADP-核糖基化状态，以促进后续几轮SSB修复。因此，PARG抑制与PARP抑制类似，降低了SSB修复的速率。
SSB是最常见的DNA病变，它们相对容易修复。相比之下，对基因组完整性构成更高威胁的DNA双链断裂（DSB）更难修复。人类细胞中有两种主要的DSB修复途径（图2）。第一种是非同源末端连接（NHEJ）途径，它修复绝大多数双端DSB。如果DNA复制叉在S期出错形成单端DSB，NHEJ可以通过重新连接不同染色体上的DNA末端来产生染色体重排。NHEJ途径不使用同源模板进行修复，在大多数时候都是非常高效和准确的。Ku是一种由Ku70和Ku80亚基组成的篮状异二聚体蛋白复合物，识别并结合断裂的DNA末端（图2）。Ku主要作为下游NHEJ成分的招募平台，同时保护DNA末端不被细胞解旋酶解旋与核酸酶降解。Ku结合DNA末端快速招募DNA依赖蛋白激酶（DNA-PK）催化亚基（DNA- PKcs）形成DNA-PK全酶，从而促进DNA连接。NHEJ途径中DNA-PK激酶的底物是DNA-PK激酶本身。这种自磷酸化对修复过程是必不可少的，因为它促进了DNA末端的突触伸展以及DNA-PK从DNA末端分离。NHEJ辅助因子，包括特殊的核酸酶和聚合酶，也能促进特定情况下准确的DSB修复。
第二种是同源重组（HR）途径。与NHEJ相比，HR通路使用同源DNA分子（通常是姐妹染色单体）作为修复的模板。当核酸酶消化DSB位点的双链DNA末端产生单链DNA（ssDNA）悬垂时，HR就被启动，这个过程被称为“DNA末端切除”。Ku从DNA末端分离，产生ssDNA束，并迅速被复制蛋白A（RPA）包裹。DNA末端切除在细胞周期中受到严格控制，只发生在S和G2期间。这也阻止了二倍体细胞使用同源染色体而不是姐妹染色单体作为修复的模板（否则可能会导致杂合性的丧失）。
DNA损伤位点的染色质修饰控制DNA修复途径的选择
细胞周期依赖性磷酸化事件(例如，CDKs磷酸CtIP磷酸化)介导细胞周期的S期和G2期的DNA切除和HR启动，但NHEJ仍然是整个间期的主要DSB修复途径。BRCA1的稳定结合伙伴BARD1和53BP1在染色质水平上调控了DSB的修复，它们分别竞争促进和拮抗末端切除。BARD1和53BP1是组蛋白H2A Lys15（H2AK15）泛素化的“解码器”，它是由RNF168沉积的DNA损伤介导的组蛋白修饰（图1）和组蛋白H4Lys20（H4K20）甲基化状态。组蛋白H4 Lys20二甲基化是沉积在成熟染色质上的组蛋白修饰，因此在S期新生的子DNA链中缺失。65H4K20me2，53BP1直接与含有H2AK15ub的核小体结合，招募下游效应蛋白，包括RIF1和shieldin蛋白复合物，调节染色质3D结构，保护DSB末端，招募DNA聚合酶α来填补切除过程中产生的ssDNA缺口，抵消DNA末端切除。
53bp1介导的NHEJ在S期，复制叉出错会导致单端DSB的产生。当来两个自不同染色体的单端DSB被连接时，染色体易位就会出现。因此，在复制过程中发生的DSB必须由HR而不是NHEJ来修复。这是通过BRCA1-BARD1复合物实现的，该复合物与53BP1一样，可以识别RNF168介导的组蛋白H2A Lys15泛素化标记(图1)，但结合的是未甲基化的组蛋白H4 Lys20，而不是二甲基化的组蛋白H4Lys20。复制叉附近的新生染色质在未甲基化的组蛋白H4 Lys20 中富集，而成熟的染色质复制后在H4K20上逐渐甲基化。通过这种方式 ，细胞确保53BP1在成熟染色质中发生的DSBs间期促进NHEJ，而BRCA1被招募到DNA复制过程中发生的DSBs近端染色质中，并被HR修复。在S期，53BP1仍会被招募到DSB上，这有助于维持HR的准确性。如果DNA末端没有被广泛切除，则替代末端连接(图2)可用于修复DSB。替代末端连接和单链退火途径都具有高度致突变性，只有当更准确的修复途径（NHEJ或HR）受到损害时才被启用。最新的证据支持了这个模型，在细胞分裂之前，POLQ依赖性DSB修复持续受到限制，一直到开始有丝分裂。在有丝分裂中，染色体分离可能导致微核和灾难性事件，如断裂-融合-桥循环和染色体碎裂，这两者都是癌症中染色体不稳定的来源。
图2.DSB修复的主要和备用途径
癌症靶向治疗中的PARP抑制剂
BRCA1或BRCA2的生殖系杂合子突变使受影响的个体易患多种癌症，包括乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌和胰腺癌。如前所述，BRCA1和BRCA2通过HR途径促进准确的DNA修复，这对于保持基因组完整性至关重要，尤其是在暴露于电离辐射或DNA链间交联剂等DNA损伤治疗后。BRCA1和BRCA2本身并不需要复制，但它们通过阻止核酸酶对新生DNA的降解和促进断裂复制叉的HR修复来促进复制。当BRCA1或BRCA2缺失时，由复制失败引起的DNA损伤会积累。它们通过容易出错的备份途径进行修复，产生基因组改变（插入、缺失和染色体重排），对基因组完整性构成威胁，从长远来看，会促进肿瘤发生。
BRCA1/2 缺陷细胞和HR 缺陷细胞对 PARP 抑制剂的极度敏感，普遍认为是由于抑制 PARP 依赖性 SSB 修复途径会导致复制过程中 DNA 损伤（SSB 和 DSB）的积累。基于PARP抑制剂和BRCA1/2缺陷之间的相关性，目前已经建立了一系列范例，在HR缺陷的癌症中，选择性靶向DNA损伤反应因子。这为未来的癌症研究和临床应用提供了一个有价值的参考。在临床中使用PARP抑制剂的主要缺点就是耐药性，其中一些已经在早期临床试验中进行了测试。
临床上DDR激酶相关的靶向药物
ATM抑制剂
ATM是协调DSB修复的DDR激酶，因此已经开发出多种化合物用于其选择性抑制 (表1) 。ATM在DSB信号转导和修复中的具有关键作用，ATM抑制联合放疗是一种备受关注的肿瘤根除治疗组合。早期研究发现特定的ATM抑制剂可以用于增加 DNA损伤剂的抗癌活性，如拓扑异构酶抑制剂或PARP抑制剂。此外，ATM缺陷使癌细胞对拓扑异构酶1抑制剂或PARP抑制剂敏感。ATM在散发癌症中经常发生突变或失活，包括肺癌、乳腺癌、大脑或胰腺癌。在机制上，PARP和拓扑异构酶1抑制剂介导产生单端DSB，这需要HR来进行准确的修复。ATM信号缺失延迟了末端切除，并将单端DSB修复到NHEJ，从而导致错误的染色体融合。对NHEJ至关重要的XRCC4、LIG4或XLF的敲除，促进了ATM缺陷细胞对PARP或拓扑异构酶1抑制剂的耐药性，因为单端DSB可以被HR修复。ATM抑制逆转了brca1-53bp1缺陷或brca1-rev7缺陷小鼠细胞中 PARP抑制剂的耐药性。因此，ATM抑制剂与PARP或拓扑异构酶1抑制剂联合使用可能是一种很有前途的治疗策略。
表1.DDR抑制剂的部分临床试验
尽管正在进行一些临床试验 (表1) ，但ATM抑制剂的临床疗效尚未得到证实。同样值得注意的是，生殖系杂合子ATM突变易导致血液系统恶性肿瘤和其他癌症类型。因此，应该仔细考虑确保ATM抑制的治疗益处超过癌症患者的风险，因为长期暴露于ATM抑制剂可能导致多种组织中的新生肿瘤形成。
DNA-PKcs抑制剂
DNA-PKcs是全酶DNA-PK的催化亚基，其中也包括Ku70和Ku80蛋白。缺乏DNA-PKcs的细胞对DSB诱导剂敏感，用DNA-PKcs抑制剂治疗重现了这种效应。与ATM类似，DNA-PKcs抑制联合放疗是一种备受关注的抗癌策略。抑制剂ATM和DNA-PKcs最近都进入了I期临床试验，但尚未有公开的数据。
ATR抑制剂
激酶ATR在S期起作用，通过调节起始点和分叉进程来确保及时和准确的DNA复制。因为癌细胞经常积累停止的复制叉，它们变得依赖于ATR信号来维持DNA复制。由于p53缺失或癌基因激活而导致G1-S过渡控制缺陷的细胞也依赖于ATR信号通路。因此，ATR是癌症治疗的一个重要的靶点，近年来已经开发出了多种特异性和有效的ATR抑制剂（表1）。ATR抑制剂增加复制叉停滞，促进染色体断裂，导致细胞毒性。由编码细胞周期蛋白的致癌基因E1的致癌基因过表达引起的复制应激癌细胞，对ATR抑制剂特别敏感。在ALK-和MYCN扩增神经母细胞瘤的异种移植小鼠模型中也观察到类似的结果，其中ATR抑制导致了肿瘤生长的抑制。携带ATM突变并干扰DNA修复的癌细胞也对ATR抑制剂敏感。
CHK1抑制剂
与ATR抑制剂类似，CHK1抑制剂加剧了PARP抑制引起的DNA损伤。使用CHK1抑制剂治疗可激活I型干扰素信号通路，与抗PDL1免疫治疗联合治疗可在小鼠小细胞肺癌模型中产生协同抗肿瘤反应。一些CHK1抑制剂在最初的临床试验中显示出了实质性的毒性，目前一些更安全的新型候选化合物也正在进行临床测试（表1）。
WEE1和PKMYT1抑制剂
酪氨酸激酶WEE1负责CDK1的抑制性磷酸化，从而阻止进入有丝分裂。因此，用WEE1抑制剂治疗会导致异常进入有丝分裂，这是这些化合物的细胞毒性基础。S期CDK1的激活也会导致SLX4-MUS81复合物增强切割停止的复制叉和DNA损伤的毒性积累。WEE1的抑制与三甲基化组蛋白H3Lys3s36（H3K36me3）的缺失，共同导致癌细胞死亡。这经常在缺乏组蛋白甲基转移酶SETD2或过表达组蛋白赖氨酸去甲基化酶KDM4A151的癌症中发现。
最新的研究确认了类WEE1激酶PKMYT1与细胞周期蛋白E过表达联合导致癌细胞死亡。PKMYT1 抑制剂 RP-6306 在治疗过表达细胞周期蛋白E的癌细胞中，意外的触发了CDK1的激活，并且该抑制剂在异种移植或PDX模型中单独或与吉西他滨联合使用，都表现出有效的体内抗肿瘤活性。该抑制剂目前正在实体瘤患者的I期临床试验中进行测试（表 1）
总结
这篇综述阐明了DNA代谢反应（复制和修复）的细胞过程。DNA损伤反应网络高度协调，以确保染色体的完整性。靶向DNA损伤反应可能是抑制癌细胞生长的可行策略。这种方法面临的挑战是如何专门针对肿瘤中的DNA损伤反应，而不影响正常组织。目前已经取得了实质性进展，通过识别促进肿瘤生长的特定基因改变，同时使肿瘤在这种特定遗传背景下易接受具有选择性毒性的DNA损伤反应靶向治疗。此外本文还提到了许多新兴疗法和新靶点，如POLQ抑制剂靶向 HR 缺陷癌症，USP1抑制剂靶向BRCA1/2缺陷癌症，RAD51抑制剂，靶向解旋酶WRN等等。
肿瘤基因组具有不稳定性，容易产生获得性治疗耐药，至今仍是临床上难以逾越的障碍。 优化药物组合，用药时间和给药方案，可以降低毒性并限制或抑制耐药性。如本综述中所讨论的，多种靶向DDR通路的新化合物最近已经被开发出来，那些在临床前环境中显示出良好结果的化合物正在在患者中进行评估。但这种经验性的方法可能不适用于癌症这样复杂的疾病。因此，未来开发药物新靶点是热门趋势，优化药物组合，减少副作用并最大限度地提高临床疗效。
编译：杨自强、吴星
审校：张军、缪长虹
参考文献：
Groelly F J, Fawkes M, Dagg R A, et al. Targeting DNA damage response pathways in cancer[J]. Nature Reviews Cancer, , 23(2): 78-94.
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